薄層クロマトグラフィーを用いてアミノ酸を分離しよう担当教員黒木勝久 TA 福島文恵アミノ酸とは？我々の体ではたらくタンパク質は、一つ一つのアミノ酸がつながることで出来上がります。小さいものでも 50 個程度のアミノ酸が連なっている非常に大きな分子です。自然界には、約 500 種類のアミノ酸がありますが、その内、ヒトのタンパク質は 20 種類のアミノ酸から合成されています。(現在までのところ、21 種類のアミノ酸から合成されていることが知られていますが、その 1 種類は極めてレアなため通常はカウントされません。) このたった 20 種類しかないアミノ酸から、50 万種類ほどの多様なタンパク質が生み出されることで、我々は健康に過ごすことができます。そういう意味で、アミノ酸は我々の体には無くてはならない存在であるということができます。アミノ酸はどんな形をしているの？アミノ酸は、その名前が示すとおり、アミノ(塩基・アルカリ性)をもつ酸であります。その中でも、タンパク質の材料となるアミノ酸は中心の炭素原子(C)にアミノ基(-NH2)とカルボキシル基(-COOH)が繋がっています(下図)。アミノ基とカルボキシル基以外にも水素原子(-H)と“カメレオンのようにコロコロと姿が変えるもの”も繋がっています。この“カメレオン”は 20 通りに変身することができるので、タンパク質を構成するアミノ酸は 20 種類ということになります。アミノ酸の形このカメレオンが水素原子のときはグリシンとよばれ、メチル基(-CH3)のときはアラニンとよばれます。うまみ成分の一つでもあるグルタミン酸は、この“カメレオン部位”が-CH2CH2COOH となっています。グリシンアラニングルタミン酸アミノ酸の種類によって何が違うの？たくさんの種類があるアミノ酸ですが、一つ一つのアミノ酸は形が異なるだけでなく、化学的性質も異なります。これらの違いにより、タンパク質合成に使用されなかったアミノ酸(遊離アミノ酸)は様々な役割をもつことになります。例えば、グルタミン酸のカメレオン部位には酸(カルボキシル基)があります。ほかのアミノ酸に比べ、酸が一つ多いので酸性アミノ酸とよばれ、我々が食事として摂取した際には、旨みを感じさせてくれる貴重な調味料成分として活躍しています。ほかにも、フェニルアラニンと呼ばれるアミノ酸は、カメレオン部位に芳香環(ベンゼン)を有しており、体内では、極めて重要な脳内ホルモンの材料になります。また、カメレオン部位による化学的性質の違いは、アミノ酸の種類を突き止めることにも利用することができます。アミノ酸の種類を突き止める一つの方法として、“薄層クロマトグラフィー”が知られています。薄層クロマトグラフィーとは何？薄層クロマトグラフィーとは、物質（アミノ酸）の化学的性質の違いを利用することで分離する解析法です。薄層プレートと呼ばれる“魔法の紙”を使用するわけですが、実は、薄層プレートの表面にはシリカゲルという物質がコーティングされています。このシリカゲルが“魔法の正体”ですが、シリカゲルは“水に溶けやすい物質”とくっつきやすいという特徴をもっています。このシリカゲルへの吸着と薄層表面を這い上がってくる展開溶媒への“溶けやすさ”のせめぎあいで、物質(アミノ酸)は薄層表面を移動します。この移動距離は物質(アミノ酸)の化学的性質のよって様々であることから、アミノ酸は薄層クロマトグラフィーにより分離することができるわけです。＊化学的性質の一つに“水への溶けやすさ”というものがあり、水に溶けにくい物質は“水への溶けやすさ”は低いということになります。この“水への溶けやすさ”は物質の大きさや形、電荷など様々な要因が関係します。アミノ酸を目でみるにはどうするの？アミノ酸を薄層クロマトグラフィーで展開した後は、どこにアミノ酸があるかを観察する必要があります。しかし、薄層プレート上では、アミノ酸を見ることはできません。そこで、アミノ酸に色つけることで目に見えるようにします。アミノ酸に色をつける方法として、ニンヒドリン反応がよく利用されます。この反応は、ニンヒドリンという物質がアミノ酸と化学反応を起こすことで、紫色の物質が生み出され、アミノ酸の位置を教えてくれます。実際にアミノ酸を薄層クロマトグラフィーで分離しよう今回、皆さんには、6 種類のアミノ酸と 1 種類のアミノ酸混合溶液を薄層クロマトグラフィーにて分離してもらいます。そして、アミノ酸混合溶液にどんなアミノ酸が含まれているのかを当ててもらいます。以下が、今回、使用する 6 種類のアミノ酸です。グリシン(G) グルタミン酸(E) メチオニン(M) トリプトファン(W) フェニルアラニン(F) リシン(K) 実験 1. 600 ml のビーカーに展開溶媒を加える。ブタノール 4 ml, 酢酸 2 ml, 水 1ml をマイクロピペットをもちいてビーカーに入れ、よく混合したのち、サランラップで密閉する。 2. 薄層プレート上の鉛筆で記してある点に、各アミノ酸溶液をスポットする。この際、マイクロピッペットもしくはマイクロキャピラリーを用いてスポットする。G, E, M, W, F, K, X のアミノ酸溶液を対応する点にスポットする。 3. サンプルをスポットした薄層プレートをドライヤーで乾燥させたのち、展開溶媒の入ったビーカーに入れる。 4. 展開溶媒が一番上に来るまで、待機する(1~1.5 時間程度)。 5. 薄層プレートを取り出し、ドライヤーで乾かしたのちに、噴霧器を使用して、ニンヒドリン溶液を薄層プレートに吹き付ける。 6. 薄層プレートをホットプレート上に置き、スポットが確認できたら、直ちに、薄層プレートを取り上げる。実験終了。＊ニンヒドリンは、タンパク質などとも反応しますので、実験中は必ず手袋を着用して操作をしましょう。