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PREVENZIONE DELLA CELIACHIA:
IDENTIFICAZIONE DEI FATTORI DI
RISCHIO
Dr. Martina Galatola
3° Congresso Nazionale AIC
“CELIACHIA E TERAPIA»
Roma, 7 Novembre 2014
1. RISCHIO GENETICO: IDENTIFICAZIONE DEI
GENI CHE PREDISPONGONO ALLA CELIACHIA
Il 95% dei celiaci è portatore di almeno una molecola a rischio DQ2 e/o DQ8, tali molecole sono
presenti anche nel 30-35% della popolazione generale.
L’ HLA è una condizione necessaria ma non sufficiente per la suscettibilità alla
celiachia
GENI NON-HLA:
1)
Studi associazione
CASO-CONTROLLO (GWAs)
43 geni
-maggiormante replicati
-funzionalmete plausibili
2) Studio di associazione familiare
-Sono stati analizzati 11 SNPs
LPP , RGS1, REL
Procedura:
L’utilizzo dell’approccio Bayesiano per calcolare sulla base dell’HLA e del
genotipo dei tre SNP , uno score di rischio per ogni soggetto
Predizione:
i soggetti che hanno uno score arbitrario di rischio più alto hanno
maggiore probabilità di sviluppare la celiachia.
Risultato:
Riclassificazione dei soggetti
Score di Bayes per le possibili combinazioni
aplotipiche (HLA + 3 SNPs) presenti nella coorte
di studio
Aumento del rischio a priori per classe HLA sommando
gli alleli di rischio “A” per i 3 SNP analizzati
350,00
300,00
250,00
DQ22
No Dq2 or DQ8
200,00
DQ2T
DQ2
150,00
DQ8
NODQ
100,00
DQ8
50,00
Double DQB1*02
0,00
2
3
3
3,5
3,75
4
4,25
4,5
4,75
5
N° di alleli di rischio “A”
5,5
6
Rischio a posteriori per classe HLA
sommando gli alleli di rischio “A”
0,35
•DQ2 omozigote: 21%
30%
0,30
•DQ2 in trans: 17%
26%
0,25
•DQ2 eterozigote: 6%
DQ22
0,20
Score
17%
DQ2T
0,15
DQ2
•DQ8: 5%
13%
•DQ negativi: 0.6%
5%
DQ8
0,10
DQ--
0,05
0,00
2,00 3,00 3,00 3,50 3,75 4,00 4,25 4,50 4,75 5,00 5,50 6,00
N° di alleli di rischio “A”
Percentuali di rischio in base
all’HLA rispetto all’aggiunta
degli alleli di rischio per i tre
SNP associati.
WORK IN PROGRESS…
PROGETTO BIOCEL
Tre geni non-HLA: LPP, cREL, RGS1 hanno costituito un modello predittivo per la stima
del rischio di sviluppare la malattia celiaca
Obiettivo: validare in una nuova coorte il modello predittivo
sviluppato nel nostro precedente studio
COORTE BIOCEL
155 che rispettano i
194
FAMIGLIE
criteri:
o Un figlio celiaco
o Entrambi i genitori
o Almeno un fratello
128
o Genotipizzazione HLA
o Genotipizzazione dei tre SNPs nonHLA
• LPP
• RGS1
71 Probandi
• cREL
71 analizzate
293
soggetti
102
Celiaci
31 Familiari
191 Sani
o Valutazione del rischio Bayesiano per la costituzione del modello
predittivo
MODELLO DI RISCHIO
Fratello di un celiaco
Fratello di un celiaco
HLA DQ2 eterozigote;
DQ8;
DQ negativi
HLA DQ2 omozigote
o DQ2 in trans 2
HLA DQ2 omozigote
o DQ2 in trans 2
HLA
HLA DQ negativi
HLA
HLA DQ2 in trans;
DQ2 eterozigote; DQ8;
ALTO RISCHIO
BASSO RISCHIO
SB ≥ mediana
ALTO RISCHIO
SB
LPP,
RGS1,
REL
SB < mediana
BASSO RISCHIO
101 fratelli
Soggetti in esame
Rischio HLA
Rischio NON-HLA
Combinazione rischio
HLA + NON-HLA
BASSO
ALTO
INTERMEDIO
Classe G1-G2
Classi G3-G4
Classe G5
33
48
20
ALTO
BASSO
Score bayes ≥ mediana
Score bayes < mediana
26
22
ALTO
33+26=
59
BASSO
20+22=
42
RISULTATI
Gruppo di
appartenenza predetto
HLA
Sani
Malati
Gruppo di reale Sani
appartenenza
Malati
151 (79%)
40 (21%)
191
15 (48%)
16 (52%)
31
HLA+
3 SNP
Gruppo di
appartenenza predetto
Gruppo di reale
appartenenza
Sani
Malati
Sani
114 (60%)
77 (40%)
191
Malati
5 (16%)
26 (84%)
31
CONCLUSIONI
Il modello predittivo dai noi proposto ha dimostrato un più
alta sensibilità rispetto al solo HLA e quindi una migliore
capacità di individuare i soggetti affetti (26Vs 16)
Più elevato potere predittivo negativo rispetto al solo HLA
(96% Vs 90%) e quindi la capacità di individuare i soggetti
meno predisposti nonostante abbiano un fratello celiaco
Questo approccio lascia ben sperare nel suo potenziale
identificativo dei soggetti non a rischio, che verrebbero così
eliminati dal follow-up.
2. ESPRESSIONE DI GENI IDENTIFICATI DA
STUDI DI ASSOCIAZIONE
La genomica da sola è in grado di spiegare solo
una quota della componente genetica della
celiachia, la rimanente percentuale è
attribuibile a meccanismi di epigenetica:
•Regolazione dell’espressione genica
•Metilazione del DNA
•Azione di micro-RNA
I Step:
Analisi dell’espressione genica dei geni candidati in pazienti celiaci e controlli sani in diversi
tessuti umani:
•Mucosa intestinale
•Monociti isolati da sangue periferico
IL NOSTRO STUDIO
Esplorare i livelli di espressione genica in un set di geni candidati in:
• Mucosa Intestinale: di 9 controlli, 9 CD and 6 CD a GFD
• Monociti di sangue periferico: di 18 controlli, 17 CD, 5 CD a GFD, e
11 pazienti affetti dal morbo di Crohn.
ANALISI DISCRIMINANTE IN MUCOSA
INTESTINALE
Lo scopo dell’analisi discriminante è quello di “pesare” la capacità di ogni singolo gene, di
discriminare tra due gruppi di individui (es. CD e CTR)
Candidate
genes
TNFAIP3
IL-21
c-REL
RGS1
LPP
Step
1
2
3
4
5
Wilks’
Lambda
0.404
0.300
0.261
0.235
0.222
Exact F
Statistic
59.002
45.521
35.809
30.143
25.272
CTR
p value
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
CD
Predicted Group Membership
Total
Count
STATUS
Control
Celiac
Control
19 (95%)
2 (10%)
Celiac
1 (5%)
20 (90%)
20
22
92,9%
DEI GRUPPI ORIGINALI
E’ CLASSIFICATA
CORRETTAMENTE!
ANALISI DISCRIMINANTE IN
MONOCITI DI SANGUE PERIFERICO
Abbiamo sviluppato una analisi discriminate simile alla precedente per i monociti di sangue periferico
Step
1
2
3
4
Candidate
genes
c-REL
LPP
TNFAIP3
KIAA1109
Wilks’
Lambda
0.138
0.090
0.062
0.048
Predicted Group
Membership
Control
Celiac
Real Group Control 10 (91%)
1 (9%)
Membership Celiac
0 (0%)
9 (100%)
Total
10
10
Exact F
Statistic
68.711
50.848
45.461
39.597
Total
11
9
20
p value
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
IL 95.5% DEI PAZIENTI
(91% DEI CONTROLLI E IL 100%
DEI PAZIENTI CELIACI)
SONO CLASSIFICATI
CORRETTAMENTE!
ANALISI DISCRIMINANTE IN
MONOCITI DI SANGUE PERIFERICO
Il D-Score per i pazienti celiaci assume valori negativi, mentre per tutti i reastanti gruppi di soggetti
(CTR, GFD-CD e pazienti Crohn) presenta valori positivi e nettamente clustrizzati.
Celiac
CONCLUSIONI
• Abbiamo ottenuto un’interessante evidenza, circa la possibile relazione che intercorre
tra l’espressione dei geni candidati nella mucosa duodenale e nei monociti di sangue
periferico.
•L’analisi di espressione su singolo gene non permette di evere una visione d’insieme sui
meccanismi patyogenetici alla base della CD. Mentre con un’approccio basato sull’analisi
discriminante è stato possibile mettere in evidenza il coinvolgimento di diversi pathway
cellulari nell’alterata risposta al glutine.
• Noi suggeriamo che l’anlisi di un piccolo numero di geni, (senza considerare HLA e dati
clinici) possa contribuire alla corretta identificazione dei soggetti a rischio, gettando le
basi per una futura diagnosi molecolare di CD.
WORK IN PROGRESS…
ESPRESSIONE LONGITUDINALE DI GENI
CANDIDATI NELLA MALATTIA CELIACA
• Identificare il potenziale ruolo diagnostico dei geni candidati della
malattia celiaca utilizzando cellule mononucleate di sangue periferico
• Analizzare le variazioni di espressione longitudinalmente nel singolo
soggetto
• Cercare di individuare eventuali correlazioni genotipo/fenotipo
TIMING
10 PAZIENTI CD
T1= 3-12 mesi (pre-diagnosi)
T2= 12-24mesi (età della diagnosi)
T3= >24 mesi (dieta senza glutine da almeno 12 mesi)
12 CONTROLLI
• T1= 3-12 mesi
• T2= 12-24 mesi
• T3= >24 mesi
• Livelli di espressione dei geni candidati
• Genotipo degli SNP associati
• Parametri Clinici
T1
T2
T3
ANALISI DISCRIMINANTE PER GLI APLOTIPI
DEI GENI CANDIDATI + HLA
Passo
1
2
3
Inserite
SH2B3_Genotype
RGS1 _Genotype
TNFRSF14_ Genotype
Originale
Conteggio
Lambda di
Wilks
Statistica
,524
,354
,278
df3
20,000
20,000
20,000
Statistica
18,182
17,307
15,552
Sig.
,000
,000
,000
Risultati della classificazione
Gruppo di appartenenza previsto
Staus
CD
Control
Totali
CD
9 (90%)
1 (10%) 10 (100%)
Control
1 (8.3%)
11 (91.7%) 12(100%)
90,9% DI CASI RAGGRUPPATI
ORIGINALI CLASSIFICATI
CORRETTAMENTE.
ANALISI DI ESPRESSIONE GENICA
PRIMA DELLA DIAGNOSI
ANALISI DISCRIMINANTE PER L’ESPRESSIONE
AL TIME PRE-DIAGNOSIDEI GENI CANDIDATI
Step
1
2
3
4
Variables
SH2B3_ T1
TAGAP_ T1
TNFSF14_T1
RGS1_T1
Wilks’
Lambda
,773
,559
,453
,369
Exact F
Statistic
5,882
7,506
7,253
7,279
Predicted Group
Membership
CD
Control
CD
10 (100%) 0 (0%)
Real Group
11
Membership Control 1 (8.3%) (91.7%)
Total
11
11
p value
,025
,004
,002
,001
Total
10
12
22
95,5% DI CASI SONO STATI CLASSIFICATI
CORRETTAMENTE.
ANALISI DISCRIMINANTE JACKKNIFE PER
TUTTE LE VARIABILI STUDIATE
Step
1
2
3
4
5
6
7
8
Variables
SH2B3_Genotype
RGS1_Genotype
TNFRSF14_Genotype
SH2B3_T1
cREL_T1
cREL_Genotype
RGS1_T1
TAGAP_T1
Real Group
Membership
Crossvalidated
CD
Control
Total
CD
Control
Total
Wilks’
Lambda
,524
,354
,278
,261
,224
,191
,161
,146
Exact F
Statistic
18,182
17,307
15,552
12,064
11,112
10,589
10,443
9,487
Predicted Group
Membership
CD
Control
10 (100%)
0 (0%)
1 (8.3%) 11 (91.7%)
11
11
9 (90%)
1 (10%)
2 (16.7%) 10 (83.3%)
11
11
p value
,000
,000
,000
,000
,000
,000
,000
,000
Total
10
12
22
10
12
22
100,0% DI CASI SONO STATI CLASSIFICATI CORRETTAMENTE.
86,4% DI CASI RAGGRUPPATI CROSS-VALIDATI CLASSIFICATI CORRETTAMENTE
CONCLUSIONI…
• L’analisi di espressione longitudinale ha parzialmente confermato lo
studio dei monociti
• L’analisi discriminante ha permesso di discriminare i pazienti celiaci
già al T1 e quindi almeno 6 mesi prima la comparsa della sierologia
e della sintomatologia!
GRAZIE PER L’ATTENZIONE!
MUCOSA INTESTINALE
P<0.05
P<0.05
P<0.05
• SH2B3
• TAGAP
• TNFSF14
• TNFRSF14
• TNFAIP3
• RGS1
MUCOSA INTESTINALE
P<0.05
P<0.05
Confermando quanto già presente in letteratura…
•IL-21 è up-regolata nei pazienti CD
•IL-2, KIAA1109 non mostrano variazioni di espressione significative
•cREL è down-regolata nei pazienti CD
MONOCITI DI SANGUE PERIFERICO
P<0.05
The expression of candidate genes in monocytes:
•
•
•
•
•
•
KIAA1109 gene was over-expressed in CD, Crohn and CD-GFD vs controls
c-REL was lower in CD monocytes
SH2B3 was lower in CD monocytes
LPP expression was lower in CD monocytes
TNFAI3 mRNA showed a modest diminution in CD patient among control and CD-GFD
RGS1 was lower in CD monocytes
QUAL’E’ LA “NOSTRA” IPOTESI BIOLOGICA?
•NFkB PATHWAY
cREL
GENI COINVOLTI NELLA REGOLAZIONE
DEL PATHWAY NFKB
TNFAIP3
IL21
RGS1
LPP
KIAA1109
CRUCIALE
NELL’ATTIVAZIONE
RISPOSTA
GLUTINE-INDOTTA
CELLULE –T CD4+
DELLA
DELLE
CONTROLLO
DELL’HOMING
LINFOCITI INTRAEPITELIALI
DEL
COINVOLTO
NELLA
REGOLAZIONE
DELL’ADESIONE E NELLA MORFOLOGIA
CELLULARE
COINVOLTO NEL DIFFERENZIAMENTO
DELLE CELLULE-T CD4+ NAÏVE IN CELLULE
TH17
•ATTIVAZIONE DEI
LINFOCITI NK
•ATTIVAZIONE DEI
LINFOCITI
INTRAEPITELIALI
•REGOLAZIONE
DELL’ADESIONE
CELLULARE
•DIFFERENZIAMENTO
DELLE CELLULE T
DIFFERENTI
PATHWAYS
PATOGENETICI
cREL AND TNFAIP3…REGULATORS OF NFkB
•Just 6 hours after gluten
exposure the NF-kB
complex is fully activated.
TNFAIP3
cREL
•cREL is one of the subunit
of the complex
•TNFAIP3 acts in a negative
feedback loop to control NFkB-dependent
gene
expression
RGS1: REGULATOR OF THE HOMING IEL
RGS1
•Elevated RGS1 levels profoundly reduce T cell migration to lymphoid-homing
chemokines, whereas RGS-1 depletion selectively enhances such hemotaxis in
gut T cells.
•Its capacity to limit egress of inflammatory and/or autoimmune cells could clearly
promote immunopathology.
LPP: AN INTEGRAL
MIGRATION.
COMPONENT
OF
CELL
•LPP gene appears to have a
relevant
activityas
cell
adhesion strength is an integral
component of cell migration.
•Regulation of LPP expression
results in a increase or
decrease, respectively, in cell
migration.
IL-21: A CRUCIAL ROLE IN THE ACTIVATION OF THE
GLUTEN-INDUCED CD4 CELLS
IL-21
IL-21
IL-21
KIAA1109: TH17 CELLS DIFFERENTIATION
• The KIAA1109 gene is
located in the region
encompassing
KIAA1109/Tenr/IL2/IL21 in
chromosome 4q27, many
times
replicated
in
association studies OF CD.
KIAA1109/Tenr/IL2/
IL21
• This cluster region is
involved differentiation of
naïve human CD4+ T cells
into Th17 cells, which
produce a variety of
cytokines including IL-17A,
IL-17F, IL-21 and IL-22.
• Genetic alterations in the
4q27 locus could results in
non-functional IL-21 and
hence lack of IL-17A or vice
PREVIOUS RESULTS….
APOC3
CYP3A3
OCLN
MAD2L1
MKI67
CXCL11
IL17A
CTLA4
MARKERS FOR VILLOUS ATROPHY
TRANSMEMBRANE TIGHT JUNCTION
PROTEIN, CONTRIBUTES TO THE
EPITHELIAL BARRIER
INFLAMMATION!!!
ASSOCIATED
WITH
CELL
PROLIFERATION, MARKERS OF CD
WITH MORPHOLOGIC CHANGE
CHEMOKINE ANTAGONIST OF THE
CCR3 RECEPTOR
ASSOCIATED CHRONIC INFLAMMATORY
AND AUTOIMMUNE DISEASES
PARTICIPATES IN THE REGULATION OF
T-LYMPHOCYTE MEDIATED
INFLAMMATORY RESPONSES,
INFLAMMED MUCOSA
VS
NORMAL MUCOSA
Bradge H et al. 2011
ANALISI DEI GENOTIPI DEI GENI
CANDIDATI
SNP
Locus
rs2816316
RGS1
C/A
0.160
AA 0% (0) AC 60% (6) CC 40% (4)
rs3748816
TNFRSF14
C/A
0.477
AA 30% (3) AC 70% (7) CC 0% (0)
rs842647
REL
A/G
0.482
AA 90% (9) AG 0% (0) GG 10% (1)
rs1464510
LPP
C/A
0.453
AA 30% (3) AC 50% (5) CC 20% (2)
KIAA1109
A/G
0.066
AA 60% (6) AG 40% (4) GG 0% (0)
rs2327832 OLIG-TNFAIP3
A/G
0.102
AA 70% (7) AG 30% (3) GG 0% (0)
rs1738074
TAGAP
A/G
0.441
AA 90% (9) AG 10% (1) GG 0% (0)
rs3184504
SH2B3
G/A
0.218
AA 100% (10) AG 0% (0) GG 0% (0)
rs2279627
TNFSF14
C/G
0.295
CC 30% (3) CG 40% (4) GG 30% (3)
rs1315196
1
Alleles M.A.F.
FREQ CD
FREQ CTR
AA 16,7% (2) AC 75% (9) CC 8,3%
(1)
AA76,9% (10) AC 22,2% (2) CC 0%
(0)
AA 66,7% (8) AG 33,3% (4) GG 0%
(0)
AA 25% (3) AC 58,3% (7) CC 16,7%
(2)
AA 62,5% (10) AG 33,3% (2) GG 0%
(0)
AA 83,3% (10) AG 8,3% (1) GG
8,3% (1)
AA 66,7% (8) AG 33,7% (4) GG 0%
(0)
AA 33,3% (4) AG 66,7% (8) GG 0%
(0)
CC 50% (6) CG 33,3% (4) GG 16,7%
(2)
χ2
p value
1,691
0,193
6,418
0,011
4,918
0,086
0,153
0,926
1,497
0,221
2,367
0,306
4,253
0,119
10,476
0,001
1,027
0,598

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