Moleculaire revolutie in de pathologie - Hinrichs

Moleculaire revolutie in de pathologie: next generation sequencing
John Hinrichs, klinisch moleculair bioloog in de pathologie
UMC Utrecht, afdeling pathologie
De (moleculaire) pathologie maakt op dit moment een grote ontwikkeling door, die in
belangrijke mate samenhangt met een veranderende behandelstrategie van
gemetastaseerde tumoren. Hierbij zien we een verschuiving van traditionele
chemotherapie naar zogenaamde “targeted” therapie, waarbij de behandeling wordt
“getarget” op het “driver” oncogen. Deze tumorspecifieke benadering noemen we ook
wel “precision medicine” of “personalized cancer treatment”[1]. Het mutatieprofiel op
DNA niveau van de tumor is hierbij leidend voor de therapie keuze en dit heeft direct
gevolgen voor de tumordiagnostiek binnen de pathologie. Door deze veranderde
vraagstelling binnen de oncologie zal naar verwachting de histologische classificatie
van tumoren steeds meer plaats gaan maken voor een moleculaire classificatie. Om
aan deze vraag vanuit de oncologie te kunnen voldoen zijn grote innovaties
noodzakelijk binnen de diagnostiek. De belangrijkste ontwikkeling hierbij is de
invoering van “massive parallel sequencing” of “next generation sequencing” (NGS)
in de pathologie diagnostiek.
Personalized cancer treatment
Bij targeted therapie wordt gebruik gemaakt van een eigenschap van tumoren die we
“oncogene addiction” noemen [2]. Dit betekent dat iedere tumor voor zijn overleving
afhankelijk is van één of meer zogenaamde “driver” mutaties. Deze “driver” mutaties
zijn het doelwit of target van de targeted therapy. Dit zijn vaak “activerende” mutaties
1
in oncogenen, die voor constante activatie van een tumor signaalroute zorgen. Een
bekend voorbeeld hiervan is de amplificatie van ERBB2 bij borst- en maag tumoren,
die voor activatie van de epidermal growth factor receptor (EGFR) signaalroute zorgt.
Met een antilichaam (trastuzumab) tegen het corresponderende eiwit HER2neu kan
de tumor specifiek worden geremd. Bij longtumoren wordt in dezelfde EGFR
signaalroute het geactiveerde tyrosine kinase domein van de EGFR receptor geremd
met tyrosine kinase remmers (erlotinib, gefitinib). Doordat de targeted therapie
specifiek is gericht tegen de activerende mutatie in de tumor, hebben cellen zonder
deze mutatie, gezonde cellen, relatief weinig last van deze therapie. Een ander groot
voordeel is dat het effect van targeted therapie goed is te voorspellen door vast te
stellen of er een activerende mutatie aanwezig is in de tumor. Daar waar de meeste
conventionele chemotherapeutica niet goed werken bij de meeste patiënten, kun je
door middel van mutatie analyse juist die patiënten selecteren die wel gevoelig zijn
voor therapie. Dat betekent dat je minder patiënten onnodig behandelt wat minder
morbiditeit en kosten met zich meebrengt. Hoewel de meeste tumoren met een
“actionable” (potentieel behandelbare) mutatie in eerste instantie goed reageren op
behandeling treedt tijdens de behandeling toch vaak resistentie op [3]. Hiervoor zijn
verschillende mechanismen beschreven zoals het ontstaan van secundaire mutaties
in de bindingssite van het medicijn, zodat deze niet meer kan binden. Een ander
mechanisme van resistentie is het omschakelen naar een parallelle signaalroute,
waardoor de geremde signaal route wordt gepasseerd. Hoewel aanvankelijk
ontstaan uit dezelfde kloon van tumorcellen, wordt aangenomen dat de meeste
tumoren niet volledig homogeen zijn. Deze zogenaamde intratumor heterogeniciteit
wil zeggen dat de (genetische) eigenschappen van de tumorcellen voor een deel
identiek, maar voor een deel ook verschillend zijn. Zo kan het zijn dat het grootste
2
deel van de tumor op het moment van biopteren voornamelijk cellen met de driver
mutatie bevat en slechts een klein deel ook een tweede mutatie die tot resistentie
leidt. Tijdens behandeling gericht op de driver mutatie verandert de habitat van de
tumor en vindt een “natuurlijke” selectie plaats ten voordele van de cellen met de
tweede mutatie: “Darwin in the tumor”. Dat is de reden dat in nieuwe klinische trials
gebruik wordt gemaakt van gecombineerde therapieën, waarbij niet één maar twee of
meer signaalroutes worden geblokkeerd. Op deze manier wordt geprobeerd om al in
een vroeg stadium het ontstaan van resistentie in te dammen door ook de achterdeur
van de tumor dicht te gooien. Hiervoor is het dus van belang om alle mutaties in de
verschillende signaalroutes in kaart te brengen: een moleculair profiel van de tumor.
Next generation sequencing
NGS dankt zijn naam aan het opvolgen van de gevestigde Sanger sequencing
techniek. Bij deze laatste wordt op het tumor DNA (geïsoleerd uit paraffine of vries
coupes) eerst een PCR uitgevoerd met primers die het deel van het gen met een
activerende mutatie flankeren. Vervolgens wordt het geamplificeerde DNA
gesequenced door de synthese van de individuele fluorescent gelabelde nucleotiden.
Dit betekent in de praktijk dat voor elke mutatie “hotspot” (deel van een gen waar
activerende mutaties plaatsvinden) een afzonderlijke sequentie analyse moet worden
uitgevoerd. In het geval van het EGFR gen zijn dat er al minimaal vier (exon 18, 19,
20, 21). Voor het maken van een moleculair profiel van een tumor moeten we
tientallen genen analyseren, waarvoor we een krachtige techniek nodig hebben. Bij
NGS kunnen miljoenen DNA fragmenten tegelijk worden gesequenced, vandaar ook
wel de naam “massive parallel sequencing”[4, 5]. Dit wordt bereikt doordat DNA
3
moleculen (gefragmenteerd genomisch DNA of bijvoorbeeld PCR amplicons) eerst
individueel worden geamplificeerd (klonale amplificatie), waarna ze tegelijk worden
gesequenced in een flow cell (Illumina) of chip (Ion Torrent) (Fig. 1). Afhankelijk van
de capaciteit van de flow cell of chip kunnen enkele honderdduizenden tot miljoenen
sequentie analyses tegelijk worden uitgevoerd. Met behulp van krachtige software
worden alle afzonderlijke sequenties gerangschikt naar patiënt, genoom positie en
aan/afwezigheid van mutaties. Voor gebruik in de pathologie wordt vaak gekozen
voor het zogenaamde “amplicon sequencing”, waarbij alleen PCR amplicons met
hierin klinisch relevante mutatie hotspots worden gesequenced. Dit maakt het
mogelijk om in slechts één enkele sequence run tientallen oncogenen te analyseren
voor meerdere patiënten.
Referenties
(1) Picker A, Jackson DB. Genetic determinants of anticancer drug activity: towards a
global approach to personalized cancer medicine. Expert Rev Mol Diagn 2011
Jul;11(6):567-77.
(2) Weinstein IB. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science
2002 Jul 5;297(5578):63-4.
(3) Ellis LM, Hicklin DJ. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in
the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res 2009 Dec 15;15(24):7471-8.
(4) Metzker ML. Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet 2010
Jan;11(1):31-46.
(5) Rothberg JM, Hinz W, Rearick TM, Schultz J, Mileski W, Davey M, et al. An integrated
semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature 2011 Jul
21;475(7356):348-52.
4
Figuren
Figuur 1. Next generation sequencing. Uitgangsmateriaal voor NGS is een
zogenaamde “library” van bijvoorbeeld gefragmenteerd genoom DNA of PCR
amplicons. Bij klonale amplificatie worden deze afzonderlijke fragmenten eerst
geamplificeerd (PCR) alvorens het daadwerkelijke sequencen start. A. Bij o.a. Ion
Torrent sequencing wordt met behulp van adapters één enkel molecuul (bv PCR
amplicon) gebonden aan één bead. Miljoenen moleculen aan deze beads worden
vervolgens geamplificeerd d.m.v. een emulsie PCR. De verschillende beads zijn van
elkaar gescheiden door een oliefilm (micro reactor), waardoor je een klonale
amplificatie krijgt. De verschillende beads worden vervolgens op een chip afzonderlijk
gesequenced, doordat elke bead een eigen reactie kamer heeft. Tijdens de
sequence reactie komt bij de inbouw van ieder nucleotide een waterstof ion vrij,
waardoor een elektrisch stroompje ontstaat, dat kwantitatief wordt gemeten door een
sensor in elke reactie kamer. Afhankelijk van de gebruikte chip kan deze tot wel 80
miljoen reactiekamers bevatten. B. Bij Illumina solid phase sequencing vindt de
klonale amplificatie en sequencen plaats op dezelfde transparante slide. De klonale
amplificatie vindt plaats door het vormen van clusters d.m.v. “bridge” PCR. De
geamplificeerde moleculen worden vervolgens in een flow cell gesequenced, waarbij
ieder ingebouwd nucleotide een fluorescent lichtsignaal afgeeft dat wordt gemeten
door een fotochip. De opeenvolgende foto’s geven vervolgens de sequentie weer
van de afzonderlijke clusters. De capaciteit is vergelijkbaar met die van het Ion
Torrent systeem.
5

Download Report