FISH digitaliseren en automatisch scoren - moleculaire

Digitaliseren FISH en automatisch scoren
Dr. Elise van der Logt
Conflict of interest
Elise van der Logt:
Company:
Meeting travel expenses reimbursed
Menarini Benelux
Klinisch moleculair bioloog in de pathologie (in opleiding)
Universitair Medisch Centrum Groningen / Moleculaire Pathologie
Supervised digital FISH HER2 validation:
Unrestricted grant covering reagents
Pathologie Friesland / Moleculaire Diagnostiek
Menarini Benelux
(no influence on study design, analysis,
conclusions and writing of the paper)
WMDP
8e
Moleculaire dag
31 januari 2014
• Digitaliseren FISH: hoe werkt dat?
Digitaliseren FISH: hoe werkt dat?
• Welke systemen en analyse modulen zijn er?
- opstelling: o.a. digitale microscoop
I
N
D
E
L
• Niet meer handmatig scoren maar automatisch:
hoe werkt dat?
- instellen live beeld
- Z-stack acquisitie
I
N
- scannen coupe
• Digitalisering FISH HER2neu: validatie studie
- foto’s FISH coupes
G
• Vergelijken handmatige en automatische procedure
1
D
Opstelling (I)
D
I
I
Opstelling (II)
G
G
- gemotoriseerde microscoop:
I
I
T
T
A
A
L
L
I
I
S
S
E
E
R
R
E
E
verplaatsing tafel
switchen objectieven / filters
- filters voor FISH acquisitie
(b.v. DAPI / groen / rood)
N
lichtbron
digitale microscoop
aansturing / analyse
-objectieven
(4x / 10x / 20x / 40x / 100x)
- monochroom camera
N
D
Instellen live beeld (I):
I
Scan FISH coupe + inzoomen:
I
- DAPI / groen / rood filter (exposure)
G
geselecteerd gebied patholoog
G
D
I
I
T
A
L
T
pre-scan (4x)
live beeld (100x)
A
L
I
I
S
S
E
E
R
R
E
E
N
N
2
D
Instellen live beeld (II):
D
I
- Vlaggen zetten
I
foto betreffende gebied
G
G
I
Z-stack acquisitie
Combinatie beelden van verschillende niveaus
overlay
I
klein / groot
gebied
T
A
L
T
A
L
I
I
S
S
E
E
R
R
E
E
N
N
Z-stack acquisitie: spots op verschillende niveaus zichtbaar
D
Z-stack
overlay
Z-stack acquisitie: 3 filters
DAPI (live)
overlay = foto
bewerking achtergrond
I
9
8
7
6
5
4
3
2
1
13
12
11
0
G
I
1 foto
T
A
SpecGreen
L
I
S
E
R
SpecOrange
overlay 3 filters
E
N
3
D
Foto
D
geselecteerd gebied
Archiveren foto’s (overlay) FISH coupes
I
I
HER2neu probe
G
G
I
geen amplificatie
I
groot
T
T
klein
A
A
L
L
I
I
S
S
E
E
R
R
E
E
N
N
amplificatie
D
Archiveren foto’s (overlay) FISH coupes
D
Archiveren foto’s (overlay) FISH coupes
I
Translocatie probe
I
Translocatie probe
G
ALK break apart
G
I
c-myc break apart
c-myc/IgH fusie
breuk
geen fusie
I
T
T
A
A
L
L
I
I
S
S
E
E
R
R
E
E
N
N
ALK break apart
breuk
geen breuk
polysomie
4
D
Archiveren foto’s: training beoordelen FISH patronen
D
Archiveren foto’s: vastleggen kwaliteitscontrole
I
Normaal weefsel translocatie probe
I
Normaal weefsel translocatie probe
breuk patronen
G
= breuk
A
I
G
bepalen afkapwaarden
A
= breuk
I
cmyc b.a.
N = 100 kernen
T
T
# positieve kernen
A
A
Analist:
1
2
L
L
T37K
6
13
7
T4C
8
7
6
T24E
6
5
8
T39B
11 10
6
T36O
4
6
I
I
S
S
3
E
E
R
R
afkapwaarde = 14,7%
E
E
(= gemiddelde + 3x SD)
N
N
Digitaliseren FISH coupes
Welke systemen en analyse modulen zijn er?
4
foto’s
D-Sight fluo 5 platform (5 coupes of 200 coupe-lader)
S
- digitaliseren FISH coupes
- automatisch scoren FISH
foto’s
Y
-Ariol capture & analysis (1 coupe of 200 coupe-lader)
S
-GSL scanning platform (10 coupes of 120 coupe-lader)
T
E
M
Pannoramic scanners -250 Flash (250 coupes)
-Scan (150 coupes)
-Midi (12 coupes)
E
N
BioView Duet-3 scanner (50 coupe-lader)
GenASIs capture & analysis (9 coupes of 81 coupe-lader)
5
A
Automatisch scoren
N
D-Sight analyse module
A
Niet meer handmatig scoren maar automatisch:
hoe werkt dat?
(amplificatie HER2/neu / translocatie ALK FISH)
L
Y
-Ariol (klinisch gevalideerd HER2/neu FISH Pathvysion / translocatie ISH)
-CytoVision software (amplifcatie / translocatie ISH)
S
E
-
D-Sight FISH analyse modules
-
automatische nucleus selectie
-
spot detectie
-
spot telling
-
checken / correctie
FISHQuant module (amplificatie / translocatie ISH)
-Duet-Solo workstation (HER2/neu FISH / translocatie ISH)
M
-Accord (1 coupe; HER2/neu FISH / translocatie ISH)
-Legato (microscoop uitbreidingsset)
O
D
FISHView / Spotscan
U
(HER2/neu FISH / ALK FISH / UroVysion)
L
E
TissueStudio software (ISH)
Klinische validatie
door laboratoria
Overzicht D-Sight FISH HER2 module
foto’s
D-Sight FISH analyse module: foto’s / objectieven
B
hulpknoppen
hulpknoppen
E
O
O
objectieven
analyse
foto’s (overlay)
R
D
E
L
E
N
foto klein of groot
vergroting
selectie gebied
6
D-Sight FISH analyse module: hulpknoppen
D-Sight FISH analyse module: score + uitslag
B
B
preview
E
switchen filters
+ nucleus
O
E
HER2neu
ALK
O
O
R
barcode
aan/uit nucleus selectie
- nucleus
opslaan
analyse per nucleus
+/- spot
D
O
R
D
E
foto opslaan
galerij nucleus selectie
E
Z-stack
E
L
L
E
N
N
Automatische nucleus selectie + spot detectie
Automatische nucleus selectie + spot detectie
B
HER2neu
E
O
O
R
D
E
L
E
N
geen amplificatie
amplificatie
7
Checken analyse
Checken en correctie: nucleus selectie
B
E
O
O
R
D
E
L
E
N
100x objectief
2x inscannen: ≥ 2 foto’s
2 onafhankelijke beoordelaars
+ of - nucleus
herberekening ratio
A
N
D-Sight FISH HER2 module
B
A
E
L
Automatische nucleus selectie + spot detectie:
FISH ALK
breuk
O
Y
O
S
R
E
D
spot telling en uitslag
M
O
D
L
score richtlijn:
E
ratio HER2 en CEP17 signalen
U
L
ratio ≥2.2
E
N
amplified
E
8
Checken analyse: translocatie FISH
A
N
B
A
E
O
D-Sight FISH ALK module
L
afstand tussen signalen bepalend
O
Y
S
R
E
spot telling en uitslag
D
E
M
L
E
N
O
score richtlijn:
D
positief = ALK-breuk
U
L
E
Moleculaire diagnostiek:
T
O
• Validatie moleculaire diagnostiek:
FISH HER2neu mamma tumoren
E
L
P
A
S
• Digitaliseren HOVON pilot:
FISH translocaties lymfomen
D
• automatische FISH kleuring (Bond, Leica)
A
T
I
G
FISH HER2neu mamma tumoren
volledig automatisch procedure
I
S
N
V
A
• digitale analyse/automatisch scoren (D-Sight, Menarini)
I
• In samenwerking UMCG:
standaardiseren scoren FISH translocaties
E
• bepalen concordantie
-handmatig FISH kleuring + score (Abbott)
-automatisch FISH kleuring + score (Leica + D-Sight)
9
Digitale analyse m.b.v. D-Sight platform
Leica FISH HER2 kleuring
V
A
V
- Bond systeem
A
overnacht kleuring
L
L
I
I
D
D
A
A
T
T
I
E
- Leica HER2 FISH kit
I
probes overeenkomstig handmatige PathVysion kit Abbott
HER2 probe:
E
SpectrumOrange (17q11.2-q12)
CEP17 probe: SpectrumGreen (centromeer regio; 17p11.1-q11.1)
1) digitale foto’s
Paraffine coupes (4 µm) invasieve mamma tumoren
• technische validatie
M
tissue microarray
• klinische validatie
resecties / biopten
n = 328(2,3)
n = 100(1)
Technische validatie: automatisch vs handmatig
n = 328 (IHC-/+/++/+++)
98.8% (κ = 0.94)
Concordant
U
T
2
1
L
T
O
D
E
S
E
H
R
2) gesuperviseerde automatische analyse
A
3
T
E
Klinische validatie: automatisch vs handmatig
n = 50 (IHC-/+/++/+++)
Concordant
100%
E
Vergelijking
- Leica FISH automatisch
N
n = 50 (IHC++)
Concordant
93.8% (κ = 0.88)
- Abbott FISH/DAKO IHC handmatig
10
D
I
Automatische FISH HER2 procedure: kleuring + analyse
A
G
D
I
A
Sinds oktober 2012 – heden
N
N
O
Rondzendingen:
S
I
S
SKML
oktober 2012 / oktober 2013
NordiQC
oktober 2012 / februari 2013 / oktober 2013
E
K
D
I
100% score consensus
D
autorisatie patholoog
I
A
A
G
N
N
O
≥ 2 analisten
moleculaire uitslag
uitslag T-nummer
O
S
(bijlage LMS)
(M-nummer LMS;
conclusie
T-nummer)
(rubriek moleculaire PA
en MD conclusie)
S
I
T
T-nummer:autorisatie
autorisatieKMBP
patholoog
M-nummer:
pre-scan
pre-screen coupe
100x
≥ 2 foto’s per analist
I
G
T
20x
beoordeling
autorisatie KMBP
autorisatie patholoog
K
FISH HER2 analyse: beoordelen
autorisatie KMBP
10x
T
E
beoordeling
4x
G
O
T
FISH HER2 analyse: digitaliseren en beoordelen
I
E
E
K
K
Conclusie
• Standaardisatie van de HER2neu bepaling kan worden bereikt
met het toevoegen van gesuperviseerde automatische digitale
analyse aan automatisch kleuren.
• De combinatie van het Leica FISH systeem met het D-Sight
digitale scan platform is een geschikte methode voor het
bepalen van de HER2neu status in de klinische praktijk voor
patiënten met borstkanker.
11
S
Vergelijken handmatige en automatische procedure
Ter overweging:
A
Handmatig
Automatisch
+++
+
+
++ (archief)
+ (deel coupe)
++ (totale coupe)
++
+++
Analisten
≥2
≥2
I
Herbeoordeling
lastig
optimaal (zelfde gebied)
N
Fouten
++
+
G
Standaardisatie
+
+++
M
E
Tijd
V
Kleuring
Scoren
N
Kosten Kleuring
A
Digitaliseren
T
T
• FISH is lastige bepaling;
complexe beoordeling (meerdere analisten)
• Standaardiseren d.m.v. digitaliseren helpt;
-herbeoordeling mogelijk op hetzelfde gebied
-uitslag integreren in laboratorium management systeem
• Kwaliteit borgen:
-validatie nieuwe methoden
-deelname rondzendingen
Bedankt voor uw aandacht!
Pathologie Friesland, Leeuwarden
Universitair Medisch Centrum Groningen
Moleculaire Diagnostiek
Pathologie, Moleculair Diagnostiek
Robby Kibbelaar (MD patholoog)
Ed Schuuring (KMBP)
Ed Schuuring (KMBP)
MD team
MD team
Bert van der Vegt (patholoog)
- Deborah Kuperus
- Jan van Setten
- Jelle Conradie
Marius van den Heuvel (patholoog)
Isala klinieken, Zwolle
Pathologie
Evan Boers (patholoog)
Menarini Benelux
[email protected]
[email protected]
12

Download Report