Nieuwe diagnostische mogelijkheden binnen de klinische genetica The closer you look, the smaller you find chromosomenonderzoek Karyotypering • resolutie 4-8 Mb • alle chromosomen • ook gebalanceerde translocaties FISH • resolutie 40-100 kb • specifiek aanvragen • één locus • positie informatie op naar genoombrede diagnostiek Chromosoomonderzoek FISH arrays high-resolution arrays single gene deletions/duplications whole exome sequencing whole genome sequencing Gene chip mapping assay - Affymetrix Wat is een SNP? Variatie in het DNA van 1 nucleotide Onschuldig Ongeveer 90% van alle genetische variaties in het menselijke genoom zijn SNP's. DNA-molecuul 1 verschilt van DNA-molecuul 2 op één basepaar plaats (een C/T polymorfisme). Voorbeeld: 250K SNP array ~250.000 verschillende SNPs verspreid over het gehele genome (-Y) worden geanalyseerd Voor microdeletie en duplicatie screening, het SNP genotype niet noodzakelijk Gemiddelde probe intensiteit wordt vergeleken met controles: een maat voor de hoeveelheid DNA op die plek van het genoom voor die persoon LU MC CGH 3500 SNP 500.000 Resolutie Gene chip mapping assay - Affymetrix analyse 40 x 250,000 spots Resultaat (1) chromosoom 3p: 8.6 Mb deletie Resultaat (2) chromosoom 6p: 7.7 Mb duplicatie het belang van kopie-aantallen • • • • • trisomie microdeletie-syndromen - 22q11-deletie, Williams syndroom microduplicatie-syndromen deleties van (deel van) 1 gen - nieuwe genen/syndromen mozaieken Voorbeeld: verrassende diagnose met SNP 6 maanden • • • • • unilaterale choane stenose milde stenosis a. pulmonalis anus anterior iriscoloboom L retinacoloboom L + R • • • • • gehoorverlies (80/50 dB, gemengd) CT-scan: afwijkingen van semicirculaire kanalen/ vestibulum/cochlea voedingsproblemen recidiverende bovenste luchtweginfecties GE-reflux  CHARGE syndrome CHARGE association C - coloboma of iris or retina H - heart defects (any) A - atresia of the choanae R - retardation of growth and development G - genital anomalies E - ear abnormalities (form/function) CHD7-gen (8q12) CHARGE association 3 major criteria: • choanal atresia • coloboma • hypoplastic semicircular canals 2 minor criteria: • brainstem dysfunction • malformation of mediastinal organs (heart or oesophagus) • hypothalamic-hypophyseal dysfunction • abnormal middle or external ear • mental retardation CHARGE association 3 major criteria: • choanal atresia • coloboma • hypoplastic semicircular canals 2 minor criteria: • brainstem dysfunction • malformation of mediastinal organs (heart or oesophagus) • hypothalamic-hypophyseal dysfunction • abnormal middle or external ear • mental retardation No mutation in CHD7 SNP array  22q11.2 deletion Voorbeeld: verrassende diagnose met SNP mozaiek Down syndroom? D21S1252 57.1 index: duplicatie 57.2 vader 57.3 moeder follow up SNP-array deletion 17p11.2  Smith-Magenis syndroom Smith-Magenis syndroom Fenotype • brachycefalie, breed gelaat, prominent voorhoofd • korte neus, hypoplasie middengelaat • cupid-bow lip • hese stem Smith-Magenis syndroom Gedrag • “perfecte baby”  ernstige slaapproblemen • automutilatie (nagels uittrekken) • ‘self-hug’ • ‘lick and flip’ Differentiaal diagnose • • • • • 9q34-deletion syndroom/ Kleefstra syndroom (EHMT1-gen) Down syndroom Williams syndroom Prader-Willi syndroom 22q11.2 deletie SNP-array  Smith-Magenis syndroom Voorbeeld: vermeende XL overerving man 42 jaar - ID - coarctatie aorta, aortaklepstenosis - anusstenose - gehoorsverlies (85 dB bilateraal) - scoliose (OK) - voetafwijking (symphalangism) X-linked overerving 3 3x PND dup 10q (10 Mb) del 11q (7.5 Mb) 10 11 normaal ongebalanceerd dup10q (groen) del11q (rood) N 3 SNP-array en FISH: t(10;11)(q26.13;q24.2) Voorbeeld: ontdekken van nieuwe genen Treacher Collins syndroom • • • • • • Altug-Teber et al; Eur J Hum Genet 2004 hypoplasia of facial bones downslant ear deformities hearing loss AD inheritance mutations in TCOF1 (60-93%) Geen mutatie in TCOF1 CR678 SNP-array  156 kb deletie in 13q12.2, de novo disrupts 2 genes …  LNX2 and POLR1D POLR1D 1/12  stop mutation 232 patienten  20 mutations wat is POLR1D? subunit van RNA polymerase I and III RNA polymerase III • berokken bij transcriptie van rRNA • 2 - en 2 -subunits gist: • -subunit = AC19 en AC40 AC19 = POLR1D AC40 = POLR1C POLR1C 22 23 24 Patient Mutations within POLR1C Familial EsM17985 c.979A>T, p.Lys327X; c.836A>G, p.Arg279Gln - Man42 c.87delT, p.Gly31ValfsX23; c.835C>T, p.Arg279Trp - EsM5815 c.922+3_c.922+6del; c.836A>G, p.Arg279Gln +  AR overerving van TCS (Lowry et al. 1985) Treacher Collins syndroom 1 patient  2 nieuwe TCS genen (Dauwerse et al. Nature Genetics, 2011) Voorbeeld mosaicisme BW 2475 gram (37 wk AD) respiratore insufficientie postaxiale polydactylie L hand 2 kleine VSD’s microcefalie MRI cerebrum: normaal bronchomalacie hernia diafragmatica SNP-array Mozaiek trisomie 13 FISH: 72/400 kernen (18%) trisomie 13 Aanvullend onderzoek: 7/50 (14%) trisomie 13 trisomy 13 growth retardation 60-70% have: holoprosencephaly an/microphthalmia CLP postaxial polydactyly aplasia cutis (scalp) 80% heart defect (ASD/VSD) omphalocele kidney malformation Patient 7 BW 2475 gram (37 wk AD) respiratore insufficientie postaxiale polydactylie L hand 2 kleine VSD’s microcefalie MRI cerebrum: normaal bronchomalacie hernia diafragmatica op naar genoombrede diagnostiek Chromosoomonderzoek FISH arrays high-resolution arrays single gene deletions/duplications whole exome sequencing whole genome sequencing Voorbeeld deletie in een gen • 60-jarige man • milde ID • epilepsie • normale lengte • OFC +2.9 SDS baby 5 & 6 jaar 11 jaar 12 jaar deletie Xq21.1 63 kb interstitiële deletie • partiële deletie of BRWD3 Am J Hum Genet 2007 BRWD3 loss of function • • • • macrocefalie milde ID frontal bossing prominente oren BRWD3 loss of function • • • • macrocefalie milde ID frontal bossing prominente oren  suggestie bij NSD1-negatieve ‘Sotos’ patients? Voorbeeld: syndroomherkenning • 20 wk AD: ernstige micro/ retrognathie • SNP-array: g.a. • TOP 22 wk known NIPBL-gen c.3439 CT (p.Arg1147*)  Cornelia de Lange syndroom genetische oorzaken • • chromosomaal - steeds kleinere afwijkingen syndromaal - herkenbaar  gericht DNA-onderzoek - (nog) niet herkend op naar genoombrede diagnostiek Chromosoomonderzoek FISH arrays high-resolution arrays single gene deletions/duplications whole exome sequencing whole genome sequencing GATCACAGGTCTATCACCCTATTAACCACTCACGGGAGCTCTCCATGCATTTGGTATTTTCGTCTGGGGGGTATGCACGCGATAGCATTGCGAGACGCTGGAG CCGGAGCACCCTATGTCGCAGTATCTGTCTTTGATTCCTGCCTCATCCTATTATTTATCGCACCTACGTTCAATATTACAGGCGAACATACCTACTAAAGTGTGT TAATTAATTAATGCTTGTAGGACATAATAATAACAATTGAATGTCTGCACAGCCACTTTCCACACAGACATCATAACAAAAAATTTCCACCAAACCCCCCCNCCCC CGCTTCTGGCCACAGCACTTAAACACATCTCTGCCAAACCCCAAAAACAAAGAACCCTAACACCAGCCTAACCAGATTTCAAATTTTATCTTTTGGCGGTATGCA CTTTTAACAGTCACCCCCCAACTAACACATTATTTTCCCCTCCCACTCCCATACTACTAATCTCATCAATACAACCCCCGCCCATCCTACCCAGCACACACACAC CGCTGCTAACCCCATACCCCGAACCAACCAAACCCCAAAGACACCCCCCACAGTTTATGTAGCTTACCTCCTCAAAGCAATACACTGAAAATGTTTAGACGGGC TCACATCACCCCATAAACAAATAGGTTTGGTCCTAGCCTTTCTATTAGCTCTTAGTAAGATTACACATGCAAGCATCCCCGTTCCAGTGAGTTCACCCTCTAAAT CACCACGATCAAAAGGGACAAGCATCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCA ATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACCGCGGTCACACGATTAACCCAAGTCAATAGAAGCCGGCGTAAA GAGTGTTTTAGATCACCCCCTCCCCAATAAAGCTAAAACTCACCTGAGTTGTAAAAAACTCCAGTTGACACAAAATAGACTACGAAAGTGGCTTTAACATATCTG AACACACAATAGCTAAGACCCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGCTTAGCCCTAAACCTCAACAGTTAAATCAACAAAACTGCTCGCCAGAACACTACGAG CCACAGCTTAAAACTCAAAGGACCTGGCGGTGCTTCATATCCCTCTAGAGGAGCCTGTTCTGTAATCGATAAACCCCGATCAACCTCACCACCTCTTGCTCAGC CTATATACCGCCATCTTCAGCAAACCCTGATGAAGGCTACAAAGTAAGCGCAAGTACCCACGTAAAGACGTTAGGTCAAGGTGTAGCCCATGAGGTGGCAAGA AATGGGCTACATTTTCTACCCCAGAAAACTACGATAGCCCTTATGAAACTTAAGGGTCGAAGGTGGATTTAGCAGTAAACTGAGAGTAGAGTGCTTAGTTGAAC AGGGCCCTGAAGCGCGTACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAGTATACTTCAAAGGACATTTAACTAAAACCCCTACGCATTTATATAGAGGAGACAAGTCGTA ACATGGTAAGTGTACTGGAAAGTGCACTTGGACGAACCAGAGTGTAGCTTAACACAAAGCACCCAACTTACACTTAGGAGATTTCAACTTAACTTGACCGCTCT GAGCTAAACCTAGCCCCAAACCCACTCCACCTTACTACCAGACAACCTTAGCCAAACCATTTACCCAAATAAAGTATAGGCGATAGAAATTGAAACCTGGCGCA ATAGATATAGTACCGCAAGGGAAAGATGAAAAATTATAACCAAGCATAATATAGCAAGGACTAACCCCTATACCTTCTGCATAATGAATTAACTAGAAATAACTTT GCAAGGAGAGCCAAAGCTAAGACCCCCGAAACCAGACGAGCTACCTAAGAACAGCTAAAAGAGCACACCCGTCTATGTAGCAAAATAGTGGGAAGATTTATAG GTAGAGGCGACAAACCTACCGAGCCTGGTGATAGCTGGTTGTCCAAGATAGAATCTTAGTTCAACTTTAAATTTGCCCACAGAACCCTCTAAATCCCCTTGTAA ATTTAACTGTTAGTCCAAANAGGAACAGCTCTTTGGACACTAGGAAAAAACCTTGTAGAGAGAGTAAAAAATTTAACACCCANAGTAGGCCTCAAAGCAGCCAC CAATTAAGAAAGCGTTCAAGCTCAACACCCACTACCTAAAAAATCCCAAACATATAACTGAACTCCTCACACCCAATTGGACCAATCTATCACCCTATAGAAGAA CTAATGTTAGTATAAGTAACATGAAAACATTCTCCTCCGCATAAGCCTGCGTCAGATTAAAACACTGAACTGACAATTAACAGCCCAATATCTACAATCAACCAA CAAGTCATTATTACCCTCACTGTCAACCCAACACAGGCATGCTCATAAGGAAAGGTTAAAAAAAGTAAAAGGAACTCGGCAAATCTTACCCCGCCTGTTTACCA AAAACATCACCTCTAGCATCACCAGTATTAGAGGCACCGCCTGCCCAGTGACACATGTTTAACGGCCGCGGTACCCTAACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACT TGTTCCTTAAATAGGGACCTGTATGAATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCCCGTGAAGAGGCGGGCATAACAC AGCAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAATTTATTAATGCAAACAGTACCTAACAAACCCACAGGTCCTAAACTACCAAACCTGCATTAAAAATTTCGGTTGG GGCGACCTCGGAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAGTACATGCTAAGACTTCACCAGTCAAAGCGAACTACTATACTCAATTGATCCAATAACTTGACCAACGGA ACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAGAGTCCATATCAACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCCGATGGTGCAGCC GCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATCTACNTTCAAATTCCTCCCTGTAC GAAAGGACAAGAGAAATAAGGCCTACTTCACAAAGCGCCTTCCCCCGTAAATGATATCATCTCAACTTAGTATTATACCCACACCCACCCAAGAACAGGGTTTG TTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAAACTTTACAGTCAGAGGTTCAATTCCTCTTCTTAACAACATACCCATGGCCAACCTCCTACTCCTCAT TGTACCCATTCTAATCGCAATGGCATTCCTAATGCTTACCGAACGAAAAATTCTAGGCTATATACAACTACGCAAAGGCCCCAACGTTGTAGGCCCCTACGGGC TACTACAACCCTTCGCTGACGCCATAAAACTCTTCACCAAAGAGCCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATCACCCTCTACATCACCGCCCCGACCTTAGCTCTC ACCATCGCTCTTCTACTATGAACCCCCCTCCCCATACCCAACCCCCTGGTCAACCTCAACCTAGGCCTCCTATTTATTCTAGCCACCTCTAGCCTAGCCGTTTA CTCAATCCTCTGATCAGGGTGAGCATCAAACTCAAACTACGCCCTGATCGGCGCACTGCGAGCAGTAGCCCAAACAATCTCATATGAAGTCACCCTAGCCATC ATTCTACTATCAACATTACTAATAAGTGGCTCCTTTAACCTCTCCACCCTTATCACAACACAAGAACACCTCTGATTACTCCTGCCATCATGACCCTTGGCCATAA TATGATTTATCTCCACACTAGCAGAGACCAACCGAACCCCCTTCGACCTTGCCGAAGGGGAGTCCGAACTAGTCTCAGGCTTCAACATCGAATACGCCGCAGG CCCCTTCGCCCTATTCTTCATAGCCGAATACANAAACATTATTATAATAAACACCCTCACCACTNCAATCTTCCTAGGAACAACATATGACGCACTCTCCCCTGA ACTCTACACAACATATTTTGTCACCAAGACCCTACTTCTAACCTCCCTGTTCTTATGAATTCGAACAGCATACCCCCGATTCCGCTACGACCAACTCATACACCT CCTATGAAAAAACTTCCTACCACTCACCCTAGCATTACTTATATGATATGTCTCCATACCCATTACAATCTCCAGCATTCCCCCTCAAACCTAAGAAATATGTCTG ATAAAAGAGTTACTTTGATAGAGTAAATAATAGGAGCTTAAACCCCCTTATTTCTAGGACTATGAGAATCGAACCCATCCCTGAGAATCCAAAATTCTCCGTGCC ACCTATCACACCCCATCCTAAAGTAAGGTCAGCTAAATAAGCTATCGGGCCCATACCCCGAAAATGTTGGTTATACCCTTCCCGTACTAATTAATCCCCTGGCC CAACCCGTCATCTACTCTACCATCTTTGCAGGCACACTCATCACAGCGCTAAGCTCGCACTGATTTTTTACCTGAGTAGGCCTAGAAATAAACATGCTAGCTTTT ATTCCAGTTCTAACCAAAAAAATAAACCCTCGTTCCACAGAAGCTGCCATCAAGTATTTCCTCACGCAAGCAACCGCATCCATAATCCTTCTAATAGCTATCCTC TTCAACAATATACTCTCCGGACAATGAACCATAACCAATACTACCAATCAATACTCATCATTAATAATCATAATAGCTATAGCAATAAAACTAGGAATAGCCCCCT TTCACTTCTGAGTCCCAGAGGTTACCCAAGGCACCCCTCTGACATCCGGCCTGCTTCTTCTCACATGACAAAAACTAGCCCCCATCTCAATCATATACCAAATC de uitkomst Voorbeeld: whole exome sequening • • • • • • AD 39 wk, 2470 gram microcefalie proptose hypotonie arthrogrypose ulnaire deviatie handen patient 1 • • • • • • AD 39 wk, 2470 gram microcefalie proptose hypotonie arthrogrypose ulnaire deviatie handen  suggesties? whole exome sequencing: ‘we zien een insertie van 4 bp in ASXL1, kan dit passen?’  JA! Oberklaid-Danks/Bohring-Opitz S. Voorbeeld: phenotype past niet bij gen • ernstige ID • epilepsie • stereotypieën • slaapproblemen • recidiverende luchtweginfecties • pubertas praecox • brede neusbrug • lange, tapering vingers • rompataxia • hypermobiliteit • bilaterale heupdysplasie Whole exome sequencing • missense mutation exon 48 in MLL2 • de novo • in silica: pathogeen Kabuki syndroom fenotype • • • • • • • characteristic facial appearance skeletal anomalies persistence of foetal fingertip pads developmental delay postnatal growth deficiency congenital heart defects genitourinary abnormalities Kabuki syndroom 56-76% heeft mutatie in MLL2 gen • 2e gen: KDM6A • • van MLL2 is geen ander fenotype bekend dan Kabuki syndroom • nieuw fenotype? Samenvatting Nieuwe genetische technieken: • helpen syndromen te herkennen (oud en nieuw) • uitbreiding phenotype per gen interpretatie wordt uitdaging! • • - we zullen mutaties/genen missen - verkeerd labelen van mutaties aantal genen ... Aardappel ~25.000 Mens (2011) ~20.000