UF1000i

Urinescreening: overzicht van
opties voor modernisering
oktober 2014
prof dr Joris Penders
30 september 2008
Historiek van urine analyse
§ Egypte à17de eeuw: geen verandering
§ Doctriene 4 vochten à19de eeuw!
§ Uroscopy: vanaf de Middeleeuwen
“Like blood, like urine”
§ 1850: start wetenschappelijke benadering
2
Urine: een prachtig staal
§ Beschikbaar in grote hoeveelheid
§ Meestal zonder pijn of bijzondere
technieken te bekomen
§ Re-sampling is aanvaardbaar
§ En toch: ook nadelen…
Nadelen van het medium urine
§ Wanneer?
- willekeurig (“random”)
- first morning
- second morning
- timed collection (vb 12h, 24h)
- timed overnight collection
§ Hoe?
Goede patiëntvoorbereiding vereist!!
- midstream
- timed collection
4
6
Opbouw
§ Automatisatie van het urinesediment
§ Toepassingen van deze automatisatie in
de praktijk met focus op:
- sediment
- urinecultuur
§ Verdere mogelijkheden
- body fluids
- extra informatie uit flow
- combinatie van technieken
7
Urinescreening:
automatisatie van het urinesediment
30 september 2008
Microscopie
Microscopie - nadelen
§ Grote inter-individuele variatie (tot 100%!)
§ arbeidsintensief
§ Voorbehandeling:
- centrifugeren?
- tellen op natieve urine?
- kleuringen uitvoeren?
§ Referentie technieken niet gemakkelijk en
vereisen:
- kleuren van urine(sediment)
- fase-contrast microscopie
- veel ervaring van de operator
Automatische microscopie
iQ200 (Iris)
SediMAX (Menarini)
Cobas6500 (Roche)
Iris iQ200
Iris iQ200
§ “Native” (onbehandelde) urine
(3 mL; 1 mL opgezogen; 2 µL voor analyse)
§ Planar flow cell (lamination) in het objectief van
een microscoop
(~axiale hydrodynamische focusing bij flow
cytometers)
§ Stroboscopic belichting (blur-free beelden)
§ CCD-camera: 500 frames
§ APR (automated particle recognition)-based neural
network
§ Review door labtechnoloog van alle abnormale
resultaten
SediMAX (Urised)
Cobas 6500
SediMAX
§ Test volume urine: 2 mL
§ Specifiek ontworpen wegwerpbare cuvetten:
200µL
§ Centrifugatie op 260g (10 s)
§ Camera: 15 images (bright-field microscopy) at
400x (~HPF) à 2,4 µL urine geanalyseerd
§ Pipet wash
§ APR (automated particle recognition)
§ Reagentia:
* cuvetten
* gedistilleerd water
SediMax screen shots
SediMax screen shots
SediMax screen shots
Classes of particles
iQ200
RBC
WBC
White blood cell clumps
(WBCC)
SQEP
Non-squamous EC (NSE)
HYAL
Non-hyaline casts (UNCC)
Bacteria (BACT)
Crystals (UNCX)
Yeast (BYST)
Sperm (SPRM)
Mucus (MUCS)
Artifacts (ART) = unclass. part.
SediMax - Cobas
UF
RBC
WBC
RBC (micro, lysed + more)
WBC (+ more)
EPI
NEC
HYA
Pathol. Casts (PAT)
BAC
CRY
(CaOxm;CaOxd;TRI;URI)
YEA
SPRM
MUC
EC
SRC
CAST
Path Cast
Bact – H-Bact
X’Tal
YLC
Sperm
Others
Conductivity
Iris iQ200 & SediMAX & Cobas6500
§ Voordelen:
* microscopische beelden
* morfologie kan door de operator worden
beoordeeld (?)
* fysisch en softwarematig gekoppeld aan
teststrip reader
§ Nadelen:
* vaak interventie vereist voor interpretatie
* geen “expert system” beschikbaar
à Cobas 6500 is met expert systeem
beschikbaar
(self-learning maar niet door de gebruiker)
UF-1000i & UF-500
UF100
laser
Argon laser (λ=488nm)
Kortere levensduur; duur
Klassering obv Flow (kleuren en FSC) en
impedantie
UF1000i
Semiconductor laser (λ=635nm)
Flow (kleur, FSC, SSC) en
impedantie
1 telkanaal
2 telkanalen: bacteriën en sediment
DNA kleuring: phenanthridine
DNA kleuring: polymethine
Membraan kleuring: carbocyanine
UFC:
Measurement
principle & flow
Samenvatting technische
kenmerken automaten
30
Automaten mbt
automatiseren van het
urinesediment
31
iQ200 en UF vs microscpie
Conclusie: UF vs iQ200
•Minder goed voor cilinders
•Cave voor RBC en WBC
Vb: ghost cells,…
•Cave voor gisten
•Bacteriën?
Cave: software versie!
•Belang van kristallen??
32
Samenvatting eigenschappen
automaten
33
34
Automaten mbt
voorspellen urinecultuur
35
Voorspellen positieve kweken
§ Opzet: automaten gebruiken om pro-actief negatieve
kweken niet in te zetten
- tijdbesparend
- kostenbesparend (reagentia; vnl
operator-tijd)
§ Studies bestaan voor verschillende van de automaten:
- SediMAX (Falbo, JCM 2012)
- iQ200
(Stürenborg, J Clin Microbiol. 2014)
(Shah, Pediatr Infect Dis J. 2014)
- UF
(De Rosa, CCA, 2010)
(Broeren, J Clin Microbiol, 2011)
36
UF en kweken: positieve studie
Belangrijkste conclusies bij
104CFU/mL als significante cutoff:
•Cut-off:
170 BACT × 106/L
150 WBCs × 106/L
•sensitivity: 98,8%
•specificity: 76,5%
•NPV of 99.5%
•4 false negative results (1.2%)
•avoiding the culture of 57.1% of
samples.
37
De Rosa, CCA, 2010
UF en kweken: negatieve studie
Conclusies:
§Combinatie WBC met bact: geen additionele waarde
§Voor 3 gouden standaarden en sensitiviteit van 95%
Cut-off
specificiteit
Reductie kweken
Vals negatief
nulgroei
26 bact/μL
43%
20%
14%
<104CFU/mL
39 bact/μL
52%
28%
<105CFU/mL
230 bact/μL
80%
52%
0,3%
§UF niet bruikbaar wegens “nulgroei als gouden standaard”
38
Broeren, J Clin
Microbiol, 2011
Combineren automatische
urine-analyse met test strip
39
Automatische microscopie
§ SediMAX – Roche
§ iQ200
Shayanfar, CCLM, 2007
40
One (?) step beyond
urinalysis
41
Andere toepassingen
§ “body fluids” (CSV, CAPD)
iQ200, UF
§ Gingivitis
UF
§ Effectiviteit antibiotica therapie
UF
§ UWI: combinatie MALDI-TOF en UF1000
§ UWI: voorspellen kweekresultaten?
§ Ketoacidose
Urisys 2400 (test strips)
43
Automaten en analyse
van CSV
Automatische microscopie en
CSV
§ Mode “body fluids”
§ Geen publicaties SediMAX (-Cobas 6500)
§ iQ200
v The lower limits of detection (CV 20%)
- RBC: 30 /μL (urine: 25/μL)
- nucleated: 35-50 /μL (urine 18/μL)
à te hoog voor CSV
v Voor hogere waardes: goede correlaties en CV
v 2 metingen vereist: met en zonder lyse RBC
45
UF en CSV
UF100 was minder geschikt vanwege
•pitfall: lymfocyten niet/minder gedetecteerd!!
Werden deels als “other cells” geklasseerd.
•“bact” channel
46
UF en CSV
§ Vergelijking UF100 vs UF1000i: lymfocyten gedetecteerd
§ Geen storing in “bact” channel in hemorrhagische
stalen/ventriculaire drainage stalen
§ Geen background in steriele stalen
§ Zelfs correcte detectie van gisten
Nanos, CCA, 2008
47
UF1000i en CSV
§
§
§
§
§
Studie Buoro et al (Biochimica Clinica 2014)
Gouden standaard: kweek en microscopie
DC (diagnostic combinations)
DC1: glucose, eiwit, microscopie
DC2: UF (WBC en bact)
DC3: glucose, eiwit, UF (WBC en bact)
DC4: DC3 + evaluatie neutrofilie (aanwezig/afwezig)
Resultaat:
- WBC cut-off van 5/μL
- bact UF cut-off van 20 bact/μL
DC4
DC1 DC2 DC3 DC4
Bact
UF
AUC (ROC) 0,98 0,99 0,99 1,00
Opmerkingen:
slechts 4/46 culturen positief!
1,00
48
Samengevat:
automaten en CSV
§ Geen publicaties voor SediMAX (-Cobas 6500)
§ Voor iQ200 en UF:
iQ200
UF1000i
1,25 mL per bepaling
800 μL per bepaling
Tot 500 μL vereist voor lyse
---
Cave cell clumping à manuele
checks
LLQ te hoog voor CSV
LLQ geschikt voor CSV
Erg tijdsbesparend
Erg tijdsbesparend
Geen differentiatie van de WBC
Geen differentiatie van de
WBC
49
UF1000i Body Mode en CAPD
§ Fleming et al (CCLM 2014):
enige/eerste studie UF1000i in “body fluid mode”
§ Conclusies:
v Goede lineariteit
v Goede precisie (LLoQ): CV 20%
- 9×106 WBC/L
- 25×106 RBC/L
v within- en between-run imprecisie <8.0% (WBC en RBC
counts; lage en hoge UF II CONTROL
§ Opmerkingen: opgelet voor sommige stalen
50
UF en gingivitis:
speekselanalyse
UF en gingivitis: UF100
Aps, CCA, 2002
52
UF en gingivitis: UF1000i
WBC speeksel
gingivitis
Coopman, CCA, 2014
WBC speeksel
gingivitis + plaque score
53
UF en gingivitis
ROC analysis of salivary WBC
gingivitis score of 3 versus 0.
AUC = 0.82
sensitivity: 76%
specificity: 78%
at a cut-off level of 103 WBC/μl saliva.
54
UF en gingivitis
Beschikbare referentiewaardes
•op basis van UF100 en UF1000i data
•Voor normale scores (geen gingivitis)
Coopman, CCA, 2014
Aps, CCA, 2002
55
UF en gingivitis
§ Hoe kwalitatief zijn de resultaten op speeksel?
56
UF en gingivitis
Gebruik van de urine flowcytometer voor meten
van speeksel:
§Reproduceerbare metingen voor RBC, WBC,
eptiheelcellen
§Bruikbaar bij gingivitis
§Niet ter vervanging voor beoordelen caries risico of
caries evaluatie
§Wat bij tonsillitis en periodontitis?
57
Combinatie UF en Maldi-TOF
UWI: MALDI en UF1000
Opzet: strategie voor snelle screening en
identificatie van uropathogenen:
§UF1000i voor identificatie UWI
§MALDI-TOF voor identificatie rechtstreeks op het
staal
Maldi: normaal op kweek uitgevoerd.
à Op enkele uren resultaat tot op genus of species
niveau.
Wang, J Microbiol Met, 2012
59
UWI: MALDI en UF1000
60
UWI: MALDI en UF1000
Belangrijkste conclusies:
•64% negatief op UF1000i
à rapport naar clinici
•Rechtstreekse Maldi kan voor stalen met >1,2x105
tot >3,0x104 CFU/mL
à Klassiek: positief staal >105 CFU/mL
•Interferentie op MALDI bij hoge WBC
•Problemen bij infectie met 2 kiemen
•Correcte identificatie voor 95% van de stalen
•Database mogelijk met patronen van antibiotica
resistentie van de kiemen
61
Urine Flowcytometry en
voorspellen effect antibiotica
UF en antibiotica therapie
§ Studie uitgevoerd op UF100 (!)
§ Beschrijving:
- ambulante patiënten UWI
- R/ antibiotica
§ Vraagstelling:
voorspellen effectiviteit therapie op basis
van urine flow cytometrie vergelijking 0h
en 24h
63
UTI: dd responsive vs nonresponsive op antibiotica
Gessoni, CCA, 2010
UTI: dd responsive vs nonresponsive op antibiotica
BCC: bacteria cell
count
Belang van deze bevinding?
Snel(ler) beoordelen van effectiviteit anitbiotica in UWI:
•Ambulante patiënten
•Gehospitaliseerde patiënten vb para-/tetraplegie
For SCI patients hospitalised in our acute rehabilitation centre, despite different
catheterisation techniques in paraplegic and tetraplegic patients, we conclude that:
(1) the number of episodes of clinical significant nosocomial urinary infections is not
different;
(2) the mean species turnover is the same;
(3) because of the species turnover, the value of regular urine
cultures for ‘documented’ treatment of clinical relevant urinary infections
seems to be limited. So urine culture could be performed less frequent or
only when therapy becomes mandatory and
(4) no oral antibiotic has superior activity. Cefuroxime and fluoroquinolones are
acceptable first choices. Adjusting therapy to the resulting antibiotic sensitivity
screening is obviously necessary.
Penders, Spinal Cord, 2003
66
Urine Flowcytometry en
voorspellen urinecultuur
68
UF(500) en urinecultuur
§ N=344, WBC>25/μL
§ Doel:
1/ klinisch significante UWI voorspellen
2/ checken mogelijkheden nieuwe parameters (B_FSC,
B_FLH, vorm grafiek)
§ Indeling kweken:
Schiemsky, CCA, submitted
69
UF en voorspellen klinisch
relevante kweken
AUC: WBC*bact: 0,756
cut-off for BACT*WBC: 515 particles/μL
Conclusions:
•exclude an extra 9.3% urine samples from being cultured
•7 out of 32 samples that would be excluded were scored possibly clinically relevant.
None showed a growth of more than 10^5 bacteria/ml.
Acceptable since the setting is to screen urine samples in patients without clinically
overt symptoms.
•Including WBC counts in our algorithm since:
- chance for sterile pyuria involving chlamydia or tuberculosis.
- poor pre-analytical sample considerations à presence of high numbers of
70
contaminating bacteria in the absence of white blood cells.
UF en toepassing B_FSC
71
UF en toepassing B_FSC
De Rosa, CCA, 2010
72
UF500i en kweek
‘XX’: interruption of the graph due to limited bacterial count.
‘0’: graph is situated to the left, does not come across the first dotted line and showed a
distribution width comparable to the example given.
‘1’: distribution width comparable to the example given and the graph was mainly situated
before the first dotted line.
‘2’: irregularities as shown or when the distribution was skewed.
‘3’: Other graphs
Schiemsky, CCA, submitted
73
74
UF B_FSC en typering bacteriën
§ B_FLH:
geen toegevoegde waarde
§ B_FSC:
voor onderscheid gram+ vs gramSensitiviteit Specificiteit Cut-off
(ch)
Schiemsky, subm
53%
86%
34
De Rosa, CCA 2010 71%
89%
30
75
Hematurie: oorsprong
toewijzen
Oorsprong hematurie beoordelen
§ UF1000i: significante hematuria: 25
RBC/µL
§ Belang van differentiatie: nefrologie vs
urologie
§ Conventionele microscopy: eg
* RBC-cilinders
* acanthocyten
§ Meer objectief:
* flow: Kitasato criteria
* specifieke eiwitten
(microcytic) DYSMORPHIC=
70% of non-lysed RBC <81ch
NORMOCYTIC=
70% of non-lysed RBC >99ch and
60% within 50 ch
NON-CLASSIFIED= the rest
No Flag
Kitasato criteria (UFC)
Glomerular (G) vs non-glomerular (NG) hematuria:
differentiation with UF 100 flowcytometer:
§ G:
* ≥80% RBC with FSC ≤ 126
* <80% RBC with FSC ≥ 84
§ NG:
* ≥80% RBC with FSC ≥ 84
* <80% RBC with FSC ≤ 126
§ NG:
* ≥80% RBC with FSC ≤ 126
* ≥80% RBC with FSC ≥ 84
§ Mixed:
* <80% RBC with FSC ≤ 126
* <80% RBC with FSC ≥ 84
Voorbeeld: patiënt 1
(66 RBC/µL)
Voorbeeld: patiënt 1
(66 RBC/µL)
Voorbeeld: patiënt 2
(576 RBC/µL)
Voorbeeld: patiënt 2
Pre-analytische fase
Pre-analytical influences
§ Buizentransport
§ Preservatie (transport, koelkast,…)
§ Vacuum tubes (container system)
met/zonder preservatieven
Preservative tubes
§ Geteste urinetubes:
§ Conclusie:
v Transport op +20°C: geen probleem. Grotere vertragingen
dienen gepland afhankelijk van het analyt.
v Er is niet 1 enkele tube geschikt voor flowcytometrie en
teststrip
Kouri et al, CCLM, 2008
Pre-analyse en vacuum tubes
§
§
§
§
Studie obv UF100
2 fabrikanten van vacuumtubes
RBC worden met 9/μL overschat (overall bias)
69% ipv 41% boven de cut-off van 11 RBC/μL
Caleffi, CCLM, 2010
87
Kwantitatieve test strip reading
Urine ketone measurement
Etiologie Diabetische KetoAcidose
Wallace. Q J Med 2004;97:773-80
Diabetes en ketonen
§ Achtergrond qualitatieve urine test strips
ü Dipsticks = nitroprusside reactie: AcAc, (aceton), 3HB
ü Ratio 3HB/AcAc: from 1:1 – 5:1
ü Onder behandeling: 3HB à AcAc
ü Evolutie concurine is slower
ü Mogelijkheid: serum-3HB: expensive
(urine strip: 0.35 €; serum 3HB=x15)
§ Onze studie
ü 3HB kan wel gemeten worden
ü Er is een lage “renal threshold”
Renal threshold for AcAc (µmol/L)
Renal threshold for 3HB (µmol/L)
38±7
180±70
ü Concserum << concurine
ü Urine: geeft een idee over een grotere time frame
↔ serum: snap shot
Diabetes and ketones
§ 3HB: measurement principle
ü Sample + 3HB-dehydrogenase + NAD + glycine-NaOH
buffer
ü 20 min incubation
Ketonen in urine
4,0
3,5
3,0
2,5
3-Hydroxybutyric acid
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
25
-0,5
-1,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Acetoacetate (Hitachi; mmol/L)
Acetoacetate
3,5
4,0
Ketone reflectance field (Urisys 2400; mmolL)
Ketone reflectance field (Urisys 2400; mmol/L)
4,5
20
15
10
5
0
-5
0
2
4
6
8
3-Hydroxybutyrate (Hitachi; mmol/L)
10
12
Patient SA
Concentration [mmol/L] .
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
00
02
06
12
16
20
24
Hours after start insulin pump
28
32
POCT market en ketonen…
Dooley, Point of Care 2009
De plaats van specifieke
eiwitten
§ Site-selective
biomarkers
§ Proximal tubule
§ Kidney injury molecule 1
Bonventre et al., Nature Biotechnology 2010
Gebruik van bijzondere eiwitten
Gebruik van bijzondere eiwitten
Kouri et al, Scand J Clin Lab Invest 2000
Combineren van de
verschillende technieken
Flow cytometry, test strip analyse,
specifieke eiwitten
Glomerular vs non-glomerular
bij hematurie
• Deze combinatie is beter dan het
gebruik van cilinders bij UF.
• Alfa2-macroglobuline kan
hiervoor gebruikt worden maar is
vaak geen routineparameter.
Deze combinatie is een
alternatief.
Penders et al, CCLM 2007
Lokaliseren van UWI
(1)
§
1= A1M/log(WBC)
§
2= A1M
§
3= WBC (UF)
§
4= Pathological casts (UF)
§
5= Hyaline casts (UF)
§
6= Small round cells (UF)
Lokaliseren van UWI (2)
45
40
A1M
/ log(WBC)
A1M/log(WBC)
35
30
25
20
15
10
5
0
1
lower
UTI*
2
upper
UTI
4
acute
prostatitis
Test strips en albumine
De detectielimiet naar beneden halen
Albuminurie
Belangrijk als onafhankelijke risicofactor bij:
§Diabetes
§Hypertensie
§Pre-eclampsie
vmeta-analyse toont onvoldoende evidentie voor ACR of PCR
om “adverse outcome” te voorspellen
vVergelijking manuele vs automatisch aflezing van strips vs
reguliere chemie toont gemengde resultaten:
- geen voordeel voor automatische aflezing.
- wel voordeel voor automatische aflezing.
104
Methodes:
•Urisys 1100 met Chemstrip 10A
•Multistix 10SG
àDe Silva vindt geen verbeterd
effect met automatiseren van de
aflezing van test strips.
àQuid interoperator-variabiliteit??
De Silva, JOGC, 2014
105
EQC op urine test strips
Target: 30 mmol/L !!
(540 mg/dL)
Personal communication:
F. MacKenzie (NEQAS - Deputy Director106
and Consultant Clinical Scientist)
Waugh, BJOG, 2005
107
Urisys 2400
Measurement principles:
Ø Flow cell:
specific gravity
urine clarity
Ø Urine colour: compensation pad
Ø Reflectance
Reflectantie - principe
Erythrocyten
(y)=78.2-19.4 log(RBC); Spearman r=-0.680; P<0.001
LOD: 8/µL (CV=1.2%)
Leukocyten
(y)=83.7-15.4 log(WBC); Spearman r=-0.688; P<0.001
LOD: 19/µL (CV=1.2%)
Protein (albumin)
(y)= 68.2-9.26 log(albumin); Spearman r=-0.825; P<0.001
LOD: 25mg/L (CV=2.2%)
ROC curve microalbuminuria
Cut-off: 30 mg/L
Proteïnen Urisys
Sens: 86%
100
Spec: 84%
Sensitivity
80
60
40
20
0
0
20
40
60
100-Specificity
80
100

Download Report