ゲノム分子生物学1 2008年4月30日 担当: 中東 Terry Brown ゲノム Third Edition 第2章: DNA研究法 第2章: DNA研究法 •2.1 DNA操作に用いられる酵素 •ポリメラーゼ •ヌクレアーゼ •リガーゼ •修飾酵素 •2.2 DNAクローニング •クローニングベクター •2.3 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) •2.1 ポリメラーゼ Polymerase Figure 2.1 Genomes 3 (© Garland Science 2007) DNA操作に用いられる酵素 ヌクレアーゼ Nuclease リガーゼ Ligase 2.1.1 DNAポリメラーゼ 鋳型依存的DNAポリメラーゼ Figure 2.4a Genomes 3 (© Garland Science 2007) 鋳型依存的DNAポリメラーゼ Figure 2.5 Genomes 3 (© Garland Science 2007) Figure 2.6a Genomes 3 (© Garland Science 2007) Figure 2.6b Genomes 3 (© Garland Science 2007) DNAの特定領域を合成する >90℃ プライマーアニーリング<55℃ 37℃ Figure 2.28 Genomes 3 (© Garland Science 2007) 繰り返し合成 (1) Figure 2.29 (part 1 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007) 繰り返し合成 (2) Figure 2.29 (part 2 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007) •2.3 Figure 2.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) •ゲル電気泳動によるPCR産物長の確認 Figure 2.30 Genomes 3 (© Garland Science 2007) DNAポリメラーゼの持つ活性 Figure 2.7 Genomes 3 (© Garland Science 2007) DNAポリメラーゼの持つ活性 Figure 2.7a Genomes 3 (© Garland Science 2007) DNAポリメラーゼの持つ活性 Figure 2.7b Genomes 3 (© Garland Science 2007) DNAポリメラーゼの持つ活性 Figure 2.7c Genomes 3 (© Garland Science 2007) DNAポリメラーゼI 大腸菌酵素 DNAラベル Klenow polymerase PolIの5’-3’exo活 性を失わせたもの DNAラベル シーケナーゼ T7 DNAポリメラー ゼの改変 シーケンス 耐熱性ポリメラーゼ 好熱菌 PCR 逆転写酵素 レトロウィルス cDNA合成 Table 2.1 Tech Note 2.1 ヌクレアーゼ DNA, RNA, ハイブリッド Figure 2.4b Genomes 3 (© Garland Science 2007) Nucleases available from NEB(New England Biolabs) DNase I (RNase-free) Exonuclease I (E. coli) Exonuclease III (E. coli) Exonuclease T Lambda Exonuclease Micrococcal Nuclease Mung Bean Nuclease Nuclease BAL-31 RecJf T7 Exonuclease Table 2.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007) Restriction Nucleases available from NEB(New England Biolabs) A AatII Acc65I AccI AciI AclI AcuI AfeI AflII AflIII AgeI AhdI AleI AluI AlwI AlwNI ApaI ApaLI ApeKI ApoI AscI AseI AsiSI AvaI AvaII AvrII B BaeGI BaeI BamHI BanI BanII BbsI BbvCI BbvI BccI BceAI BcgI BciVI BclI BfaI BfuAI BfuCI BglI BglII BlpI Bme1580I BmgBI BmrI BmtI BpmI Bpu10I BpuEI BsaAI BsaBI BsaHI BsaI BsaJI BsaWI BsaXI BseRI BseYI BsgI BsiEI BsiHKAI BsiWI BslI BsmAI BsmBI BsmFI BsmI BsoBI Bsp1286I BspCNI BspDI BspEI BspHI BspMI BspQI BsrBI BsrDI BsrFI BsrGI BsrI BssHII BssKI BssSI BstAPI BstBI BstEII BstNI BstUI BstXI BstYI BstZ17I Bsu36I BtgI BtgZI BtsCI BtsI C Cac8I ClaI CspCI CviAII CviKI-1 CviQI D DdeI DpnI DpnII DraI DraIII DrdI E EaeI EagI EarI EciI EcoNI EcoO109I EcoP15I EcoRI EcoRV F FatI FauI Fnu4HI FokI FseI FspI H HaeII HaeIII HgaI HhaI HincII HindIII HinfI HinP1I HpaI HpaII HphI Hpy166II Hpy188I Hpy188III Hpy99I HpyAV HpyCH4III HpyCH4IV HpyCH4V K KasI KpnI M MboI MboII MfeI MluI MlyI MmeI MnlI MspA1I MspI MwoI N NaeI NarI NciI NcoI NdeI NgoMIV NheI NheI-HF™ NlaIII NlaIV NmeAIII NotI P PacI PaeR7I PciI PflFI PflMI PhoI PleI PmeI PmlI PpuMI PshAI PsiI PspGI PspOMI PspXI R RsaI RsrII S SacI SacII SalI SalI-HF™ SapI Sau3AI Sau96I SspI StuI StyD4I StyI SwaI MscI MseI MslI SbfI ScaI ScaI-HF™ ScrFI SexAI SfaNI SfcI T TaqαI TfiI TliI TseI Tsp45I Tsp509I TspMI TspRI Tth111I X XbaI XcmI XhoI XmaI XmnI Z ZraI NruI NsiI NspI PstI PvuI PvuII PvuII-HF™ SfiI SfoI SgrAI SmaI SmlI SnaBI SpeI SphI SphI-HF™ Restriction Endonuclease (制限酵素) DNAの特定の配列を認識して切断 Figure 2.9 Genomes 3 (© Garland Science 2007) 制限酵素 Restriction Enzyme 制限と修飾 (1950s) A B Aタイプの細菌で増殖したファージはBタイプの細菌での 増殖を制限される 制限酵素 Restriction Enzyme 制限と修飾 (1950s) 一旦Bタイプの細菌で増殖したファージは修飾をうけ、Bタイプの細 菌での増殖を制限されなくなる。 制限酵素 Restriction Enzyme = Restriction Endonuclease GAATTC 5’ GAATTC 5’ EcoRI 制限酵素 G AATTC G AATTC 5’ 5’ 修飾酵素 Modification Enzyme = Modification Methylase 5’ GAATTC 5’ GAATTC EcoRI 修飾酵素 認識配列2番目のアデニンをメチル化 5’ * GAATTC * GAATTC EcoRI 制限酵素 1978ノーベル生理医学賞 5’ 細胞に注入されたファージDNA 切断（制限）されて分解 制限を免れ、メチル化修飾を受けてファージとして増殖 いずれかの運命をたどる 制限酵素 DNAを特定の箇所で切断 ->特定の断片が出来る GAATTC 5’ 5’ GAATTC EcoRI 制限酵素 G G AATTC AATTC G AATTC AATTC G 断片の大きさでDNAを区別する アガロースゲル電気泳動 Technical Note 2.2 Figure T2.1 Genomes 3 (© Garland Science 2007) 違う濃度のアガロースで泳動した際の分離の差 Technical Note 2.2 Figure T2.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007) サザンブロットハイブリダイゼーション Figure 2.11 Genomes 3 (© Garland Science 2007) サザンブロットハイブリダイゼーション（１） 電気泳動後のゲルからナイロン膜にDNAを転写 Figure 2.11a Genomes 3 (© Garland Science 2007) サザンブロットハイブリダイゼーション（２） 蛍光や放射性同位体などでラベル 同じ配列を持つDNA断片に結合 Figure 2.11b Genomes 3 (© Garland Science 2007) 制限酵素の分子生物学への応用 (DNAクローニング) GAATTC 5’ GAATTC 5’ EcoRI 制限酵素 5’ AATTC AATTC 5’ G G AATTC 5’ AATTC 5’ G G 5’ 5’ どのEcoRI断片もendの 形状は同じ 平滑 粘着 Table 2.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007) Figure 2.10a Genomes 3 (© Garland Science 2007) 2.1.3 DNAリガーゼ (DNA ligase) Figure 2.4c Genomes 3 (© Garland Science 2007) 生体内でのDNAリガーゼの機能はDNA複製、修復で(秋学期) Figure 2.12a Genomes 3 (© Garland Science 2007) 平滑末端のライゲーション (T4 DNA ligase) Figure 2.12b Genomes 3 (© Garland Science 2007) 粘着末端のライゲーション (T4 DNA ligase, E. coli DNA ligase) Figure 2.12c Genomes 3 (© Garland Science 2007) •2.2 Figure 2.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007) DNAクローニング 大腸菌プラスミドに動物由来DNAをクローニングする(1) Figure 2.15 (part 1 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007) 大腸菌プラスミドに動物由来DNAをクローニングする(2) Figure 2.15 (part 2 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007) 大腸菌プラスミドに動物由来DNAをクローニングする(3) Figure 2.15 (part 3 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007) 1ng =3x108 分子 108 細胞 〜104 形質転換体 Figure 2.16 (part 2 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007) プラスミドベクターの構造 プラスミドが入った細 胞の選択の為の薬剤 耐性 大腸菌内での自律増 殖に必要なシグナル 外来遺伝子挿入の有 無を示すlacZ’遺伝子 外来遺伝子挿入の為 の制限酵素切断部位 (MCS) Figure 2.17 Genomes 3 (© Garland Science 2007) プラスミドDNAの抽出法 (1) Technical Note 2.3 Figure T2.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007) プラスミドDNAの抽出法 (2) Technical Note 2.3 Figure T2.4 Genomes 3 (© Garland Science 2007) バクテリオファージベクター Figure 2.19 Genomes 3 (© Garland Science 2007) Figure 2.19 (part 1 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007) 溶菌サイクル Figure 2.19 (part 2 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007) 溶源化サイクル λファージゲノムのいらない部分を取り去ってベクターとして使う Figure 2.20a Genomes 3 (© Garland Science 2007) λファージベクター キャプシドにパッケージできるDNAの長さはある範囲で決まっている Figure 2.20b Genomes 3 (© Garland Science 2007) λファージベクターを使ったクローニング cos-cosがヘッドにパーケージングされる Figure 2.21 Genomes 3 (© Garland Science 2007) λファージベクターを使ったクローニング Figure 2.22 Genomes 3 (© Garland Science 2007) 様々なベクターでヒトゲノムを網羅するのに必要なクローン数 Table 2.4 Genomes 3 (© Garland Science 2007) コスミド (cosmid)ベクター λファージ粒子にパーッケージされて感染し、 その後はプラスミドとしてふるまう Figure 2.23 Genomes 3 (© Garland Science 2007) 人工染色体ベクター (Yeast Artificial Chromosome, YAC) Figure 2.24 Genomes 3 (© Garland Science 2007) Figure 2.25 Genomes 3 (© Garland Science 2007) Figure 2.25a Genomes 3 (© Garland Science 2007) Figure 2.25b Genomes 3 (© Garland Science 2007) YAC以外のイーストベクター Figure 2.26a Genomes 3 (© Garland Science 2007) Figure 2.26b Genomes 3 (© Garland Science 2007) Figure 2.27 Genomes 3 (© Garland Science 2007) http://www.biotech-house.jp/glossary/glos_40.html
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