1 胃癌におけるCOX-2遺伝子の異常メチル化とヒストンの脱アセチル化 Aberrant methylation and histone deacetylation of cyclooxygenase 2 in gastric cancer. International Journal of Cancer 2002, 97: 272-277 内科学第一講座菊地剛史 2 研究の背景 COX-2遺伝子は胃癌の約８０％において発現上昇が報告されており、癌化に重要な役割を果たしていると考えられる NSAIDsやCOX-2選択的阻害薬により、胃癌の発生が 40 % 減少する報告もあり、細胞株においてアポトーシスの誘導がおきることから、過剰発現が発癌に関与している可能性が示唆される細胞増殖増殖因子発現誘導血管新生因子発現誘導 COX-2 発現上昇 PGE2 上昇 MMP-2 活性上昇 E-cadherin 発現低下浸潤能獲得 COX-2 遺伝子の発現制御機構 EGF -R RAS p53 転写抑制 MAPK 転写活性化 COX-2 COX-2 の遺伝子発現はgrowth factor など oncogenic な signal により正に、p53 などの anti-oncogenic な signal により負に制御されている 3 研究の目的 COX-2遺伝子の発現制御は不明な部分が多く、その解明は発癌機序の解明につながるものとして期待される COX-2遺伝子の上流領域に位置するCpG アイランドにおける、 COX-2遺伝子の発現制御と異常CpGメチル化について検討を行ったメチル化による遺伝子発現抑制において関連が指摘されているヒストンの脱アセチル化について検討を加え、胃癌におけるCOX-2遺伝子のエピジェネティックな発現制御機構について明らかにする 4 COBRA （COmbined Bisulfite Restriction Analysis ）法の概略 5 5m TCACAGAG CGG sodium bisulfite bisulfite& PCR Restriction& electrophoresis 5m GCA C TUAUAGAGCGG PCR GTAC Afa I site 0% 50% 100% Methylation TTATAGAGCGG 今回の検討で用いた COBRA 法は、DNAをBisulfiteで処理することにより、メチル化しているシトシンはシトシンのまま、メチル化していないシトシンはウラシルに変換される。Bisulfite処理した DNAをPCR後、メチル化アレルのみを切断する制限酵素で切断することにより、メチル化を定量的に検出出来る。 6 胃癌細胞株における COX-2 遺伝子の異常メチル化 CpG Exon 1 U TaiI M <1 <1 <1 <1 <1 <1 100 32 86 （％） RKO KatoIII JRST MKN28 RKO KatoIII MKN28 JRST NUGC3 AZ521 MKN74 MKN45 MKN7 23+164 bp 23+50+114 bp MKN7 MKN45 MKN74 AZ521 NUGC3 AfaI TaiI COBRA AfaI 100 bp U M M <1 <1 <1 <1 <1 <1 100 34 86 （％） COBRA 法により検出されたメチル化アレルを M で、非メチル化アレルを U で示している。Afa I , Tai I いずれの制限酵素処理においても、MKN28、KatoIII についてメチル化を認め、胃癌細胞株 8 株中 2 株（ 25% ）において異常メチル化を検出した。 RKO は Positive control として用いた。胃癌細胞株における COX-2 遺伝子の異常メチル化 Bisulfite-Sequence A CpG A/T A A/T CpG Unmethylated CpG Methylated CpG A : Afa I 認識CpG T : Tai I 認識CpG MKN 7 MKN 28 MKN 45 KATO III Bisulfite – Sequenceの結果を示す。COBRA法、Bisulfite-SSCP法によりメチル化を検出したMKN28,KatoIIIにおいて、メチル化はプロモーター領域全体に密におこっていることが明らかとなった。 7 胃癌細胞株における COX-2 遺伝子の発現 KatoIII MKN28 NUGC3 AZ521 MKN74 MKN45 MKN7 RT-PCR COX-2 GAPDH 異常メチル化を呈した MKN28 , KatoIII においては遺伝子の発現を認めず、メチル化と発現低下が相関することが明らかとなった。 8 胃癌手術摘出標本におけるメチル化の検出 N : Normal tissue T : Tumor tissue N124 Y-16 Y-1 N115 N114 N112 COBRA N T N T N T N T N T N T U M 0 37 0 46 0 0 0 0 0 40 0 0 (%) 手術摘出標本メチル化 93例中 11例（12％）正常胃組織メチル化 18例中 0例 93例中11例（12％）においてメチル化が認められる一方、正常胃組織についてはメチル化を認めなかった。 9 免疫染色による COX-2 遺伝子の発現の検討正常胃粘膜胃癌異常メチル化（＋）手術摘出標本発現陽性発現陰性胃癌異常メチル化（ー） 27例中発現陰性 19例（70%）メチル化 8例（30%） 10 胃癌異常メチル化（ー） 8例中 6例抗COX-2モノクローナル抗体を用いて、発現の検討を免疫染色により行った。検討では、27例に対し行い、19例においては発現を認め、8例において発現を認めなかった。発現を認めなかった8例中6例はDNAの異常メチル化を認め、異常メチル化と発現低下に相関を認めた。 Chromatin Immunoprecipitation （ ChIP ）クロマチン免疫沈降法の概略 Ac Transcription factor Ac DNA M M Ac Ac Ac M ヒストンのアセチル化状態の変化ヒストンアセチル化 M ？ Ac Ac Ac Ac Purify DNA HDAC DNA MeCP2 M M PCR M M + ヒストン M 脱アセチル化 M M M Ac Immunoprecipitation by Anti-Ac histone H3 Ac M M M M Ac Acetylation Target gene DNAメチル化によるCOX-2遺伝子発現抑制の分子機構に関して、クロマチンレベルで解析する目的で、クロマチン免疫沈降法により、ヒストンのアセチル化の状態を解析した。抗アセチル化ヒストンH3 抗体を用いて免疫沈降を行って得られたDNAを用いてPCRを行い、アセチル化の程度を定量した。 11 MKN45 MKN74 AZ521 JRST MKN7 NUGC3 MKN28 KatoIII 半定量 PCR による胃癌細胞株におけるクロマチン免疫沈降法の結果 COX-2 Anti Ac-H3 GAPDH No Ab Expression Methylation COX-2 + + + + + + 2.5 2 1.5 1 0.5 0 MKN45 MKN74 AZ521 JRST MKN7 NUGC3 MKN28 KatoIII COX-2 COX-2/GAPDH Input 3 + + Input は免疫沈降を行う前のDNA、No Abは免疫沈降の際に抗体を使用しない場合のコントロールとして用いた.。メチル化を認め、発現の低下を認めた MKN28 , KATOIII においてアセチル化ヒストンに付着したDNAが認めないことから、ヒストンの脱アセチル化が起きていることが明らかとなった。 12 胃癌細胞株における脱メチル化剤、 13 ヒストン脱アセチル化阻害剤による遺伝子再発現の検討ヒストン脱アセチル化阻害剤（TSA）脱メチル化剤（5-Aza-dC ） Aza+TSA TSA 10 （mM ） Aza-dC (-) 0.1 1 MKN28 MKN28 MKN45 MKN45 MKN28 COX-2 COX-2 GAPDH GAPDH 5-Aza-dC : 0.1mM RT-PCR により脱メチル化剤 5-Aza-dC 並びに、ヒストン脱アセチル化阻害剤 TSA 投与時における COX-2 遺伝子の再発現の検討を行った。異常メチル化を呈した胃癌細胞株 MKN28 に対する 5-Aza-dC の投与は濃度依存的に遺伝子の再発現を認めた。一方、TSA のみの投与では再発現を認めなかった。5-Aza-dC との組み合わせのTSA の追加投与により 5Aza-dC 単独投与より、発現の増強が認められた。胃癌細胞株における脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤によるヒストンのアセチル化の検討 No Ab Expression Methylation + COX-2 + + + + 0.2 0 Aza+TSA GAPDH 0.4 TSA COX-2 0.6 Aza-dC Anti Ac-H3 0.8 MKN28 COX-2 1 MKN45 Input COX-2/GAPDH 1.2 Aza+TSA TSA Aza-dC MKN28 MKN45 MKN28 MKN28 TSAの投与でヒストンの再アセチル化が確認されたが、5-Aza-dC投与のみでは遺伝子の再発現を認めるもののヒストンの再アセチル化は弱く、遺伝子の発現にはDNAの異常メチル化が優位に関与するものと考えられた。 14 まとめ胃癌細胞株 8例中2例(25%)、胃癌症例93例中11例(12%)に COX-2遺伝子の異常メチル化を認めた。 COX-2遺伝子の異常メチル化と遺伝子発現の抑制はよく相関していた。クロマチン免疫沈降法により、 COX-2の遺伝子のプロモーターがメチル化している例では、ヒストンの脱アセチル化を認めた。以上の結果から、 COX-2遺伝子の発現調節において、プロモーターのメチル化とヒストンアセチル化が重要であると考えられた。 15 異常メチル化とヒストン構造の変化による遺伝子発現抑制 Transcription factor Ac M M M : CH3 異常な遺伝子のメチル化 Ac M M Spreading of methylation Ac Ac M M M 遺伝子が発現している状態 MeCP2 M 脱メチル化ヒストンのアセチル化 M MeCP2 M M M M 16 M M M M M M M M M M ヒストンの脱アセチル化クロマチンの凝縮遺伝子の発現抑制通常遺伝子のプロモーター領域はメチル化されておらず、転写因子がアクセスしやすいようにクロマチンは開いた構造になっている。（上段）メチル化が起きると、MeCP2などのメチルCpG結合タンパクがDNAに結合し（中段右側）、ヒストン脱アセチル化酵素をリクルートする。その結果クロマチンは閉じた状態になり、遺伝子の発現は抑制される。（下段） 17 胃癌における異常メチル化の発癌への関与 CIMP in gastric cancer cell lines Gene methylated unmethylated MKN7 CIMP: CpG island methylator phenotype CIMP（－） KatoIII MKN28 CIMP（＋） MKN45 Methylation profile in gastric cancer COX-2 U M U M E-cad U M U M p57 U M U M Case Distinct methylation pattern and microsatellite instability in sporadic gastric cancer. Int J Cancer. 1999 左図に示したように、胃癌の一部はゲノムワイドなメチル化の異常が癌化に関与すると考えられる。そのような腫瘍においては、p16INK4A、E-cadherin、hMLH1 のメチル化が高頻度で認められる ( Suzuki et al, Int. J. Cancer, 1999)。右側に CIMP+ 細胞株、MKN28、Kato III およびCIMP －細胞株 MKN7、MKN45 における各種遺伝子のメチル化検出例を示す。 COX-2 の発現と癌関連遺伝子異常の関連 COX-2 K-ras p53 CIMP － ? APC COX-2阻害剤 COX-2 CIMP + Methylation E-CAD Pro-apototic gene？ p16 メチル化阻害剤一部のCIMP+ 腫瘍では、COX-2 は異常メチル化により発現ぜず、 COX-2 非依存性の発癌経路をたどる。このような腫瘍にはメチル化阻害剤が有効と考えられる. 18