576. 852. 21. 8. 095. 3 投酸性菌の物質代謝に関する研究第1編超遠心分劃法により得た磨砕菌体の可溶性分劃物と不溶性顆粒分劃物の脱水素酵素反応の研究岡山大学医学部微生物学教室(指導:村上栄教授) 林周平〔昭和34年7月16日受稿〕目Ｉ. 緒次言 malateの II. 実験材料並びに実験方法III . 成の影響績 1) 各種抗酸性菌のSf. 2) 透柝処理せるH37Ra,のSfがlactate, Ｉ. 緒 Pfの脱水素反応に及ぼすCofactor 脱水素反応言結核菌をはじめ抗酸性菌は,他の一般病原細菌に比し生物学的.理化学的性状に於て多くの相違点を IV 総括及び考案Ｖ結論襄に岡11-12)は人型,牛型両株の毒力菌と弱毒菌 (無毒菌も含む)の生菌,無細胞液につき各種基質添加のもとに脱水素酵素反応を検討し,滝沢13)は岡12)の抽出した無細胞液を更に超遠心分劃法によ示している.このことが抗酸性菌の初期酵素化学的り可溶性上清分劃と不溶性顆粒分劃に分別し,前者研究に於ける興味の中心であり,又其の研究手段とはTCA しては菌体自体が供試された-1).其の後酵素化学のが,之飛躍的進展に伴い多くの細菌が其の目的,手段に使異的に酸化するにすぎないと述べた(供試株は人型用され,又抗酸性菌もその中に含まれた. 毒力株,無毒株である).山村14-16)は鳥型竹尾株よしかし最近抗酸性菌の毒力(病原性)の問題が大きく台頭し,之に関しての生化学的研究2-3)と併行し毒力を中心としての酵素化学の研究が富に増加した.中でもBloch等4-7)による毒力菌と無毒菌の cycleに関与する多くの有機酸を酸化するに反して後者はlactate, succinateのみを特り得た該不溶性顆粒分劃はmalateのみを酸化することを以前に記録している. 以上の諸点より超遠心分劃法により得られた酵素活性の分劃は同じ抗酸性菌といえども其の種類によ脱水素酵素反応の研究は注目に値するものがある. り確かに相違した性状を示すものと考えられる.ししかし之等の研究は総て生菌を用い,臨床的応用にかし之等の諸点につき系統的に検討を行つた報告に直結するもので基礎学的検討とは異つている.又本接することが出来ないので著者は脱水素酵素反応の邦では鳥型菌を中心として広範に亘る酵素学的研究観点より之を検討した. が山村及び其の協力通8-10)によつて報告され多大の成果が得られている. 他方人型或は牛型結核菌は,鳥型及び一般抗酸性 II. 実験材料並びに実験方法供試菌株:人型毒力株. H 37 Rv(以下H 菌との間に於て毒力をはじめ,幾多の相違点を示しているに拘わらず,非病原性抗酸性菌を用いて得た型竹尾株, Myc, 成績から人型,牛型毒力菌の性状を推測したものが phlei(以下phlei)の6種多い. 立早島療所より,他の5株は予防衛生研究所より分 ATCC. 下H 37 Ra), 37 Rv), 人型無毒株. H: 37 Ra(以 607(以下ATcc), BCG,鳥 Myc. であり,鳥型竹尾株は国 5812 林周平第1表与されたものである. 培養法: 株, H 37 Rv, ATCCはsauton液 37 Ra, BCG,鳥二者は1週 Phleiはsauton培三者は間発育菌を供試しの5日培養菌を供試した. 可溶性分劃と不溶性顆粒分劃の作製法:上記発育菌を用い滝沢13)の法により作製した.即ち前記発育菌を滅菌濾紙上に集めて,脱水した湿潤菌12g に石英砂を倍量添加し,乳鉢中にて1時於て)強に0.02mol 力に磨砕し,之 PH 7.0(以間(0℃ に phosphate buffer solution. 90ml添加し,充分に攪拌せるものを最初10000rpm 下緩衝液と略す)を fumarateがにて30分間遠心し,其の上清を15000rpmにり,他称し,不溶性分劃物は其のままの状態を溶性顆粒分劃物は之に20mlの液に懸濁せしめPfとは湿潤菌5g当した.只phleiのり緩衝液50mlで添加しPfと Sf透緩衝場合のみ処理し,得た不溶性顆粒分劃には前記同様20mlのられ緩衝液をした. 柝処理法:透いでmalate, 柝処理に於ける外液は蒸溜 37 Rv, H 37 Raのpfは理法の詳細については成績の項目で述べる. 基質である場合は脱水素される.又の能力はH 37 RaのPfにに対するよりもlactateにに対しては両株のPf共われるが,著 ATPの用したものはCol, 三者で何れもGBI社脱水素酵素反応: によつた.其 riboflavine, 製のものである. Thunberg法(Mb脱の技術,内対して強い.又pyruvate に脱水素能は存在すると思明ではなく特にH 容の詳細は別項に於て述べて弱い結果を得た. 以上の如く人型結核菌のSfはを使し,其 0.25ml,緩衝液. 容れ,真の状態で5分 Pfの対照に於ても之が起に反してPfはlactate, auccinateは完対しても微弱ながら能力が存在するものと思われる.又Pfの対照は全 B) BCGの BCGは検討人型菌に比し, sauton培地上に於ける発 0.5ml,副其の色調も人型菌が茶褐色を呈しているのに比し, 脱水素反応Thun- の主室は基質 . 0.5ml, 室にSf(或淡いクリーム状である.脱水素能は第2表に示した. Mb. はPf) . 空ポンプにて水銀柱2∼3mmHg 間排気し, 37℃ 温度平衝を行い, Sf(或其の瞬間よりMbのの倒温漕にて2分はPf)を間主室に流込み, 脱色するまでの時間を測定した. 人型結核菌の検討成績の大要は第1表即ちH り得る.之供試基質の全部をた不溶性顆粒分劃は人型菌の約1/4量に過ぎない. 績各種抗酸性菌のSf, berg管 A) 於育は不良であり,の其収量も少ない.之より分離し III. 成 0.5mlを 37 RaのPfにく脱水素が認められない結果を得た. 色法) る. 1) 其於て強く,又succinate 全に脱水素し,又pyruvateに Co-factor:使あ共にlactate, succinateが種々の強さで脱水素するが,又水を使用したが,処 pyruvateでのものは之等に比すると活性が稍弱い. 又H 間超遠心分劃を行い可溶性分劃と不溶性顆粒分劃に分けた.可早く,次て30 分間遠心,得られた淡黄透明な上清を再640000rpm Sfと脱水素能地上で発育不良のため肉汁ブイヨンに発育せしめ,そにて1時 Pfの型竹尾体培地に培養し,前其の16日発育菌を,後た. H 人型菌のSf, 37 Rv. に示した. Sfはpyruvateが脱色される. lactateは最も短時間で之に次ぐが,其は稍々長時間を要する. H 37 Ra. Sfでの他の基質はlactate, 第2表 BCGのSf. Pfによる脱水素能投酸性菌の物質代謝に関する研究表に示した如く, Sfのは極めて微弱である.強各基質に対する脱水素能いていうならばfumarate に対しては稍々活性が強い.前強度のものである. 即ち鳥型菌の両分劃がそれぞれ所有する脱水素能述の如く人型菌の Sfはpyruvate, lactate等性を示したが,このような現象は全く観られなかつた.即 5813 に対して特に強力な活ち脱色は起り得るが各基質差は殆んで認め難は人型菌, BCG等と比較し大きく差のあることを示したものと思う. D) Myc, ATCCも ATCC 607の検討鳥型菌と同様にSfを用いると対照のMb脱い. 又Pfはlactate, 又lactateに succinateのみ脱色が起り, 対する脱水素能は人型菌のPf程でないが, succinateに人型菌のPfはの結果は第4表第4表に示した. Myc, 僅かながら対する活性が観られたが, BCGで色が短時間内に起り,判定を困難にならしあるので7倍に稀釈して用いた.其対する活性は人型菌との間に著差を観ない.又 pyruvateに強力そのままの濃度で ATCC 607のSf. Pfの脱水素能は全く認められなかつた. Sf. Pfの各対照の結果は人型菌と同様に,前は脱色が起り得るが,後者者は全くそれが認められない. C) 鳥型菌の検討鳥型菌の場合Sfをると,対照のMb還そのまま脱水素反応に使用す元速度が極めて早く,添質の効果判定が困難のため,緩加基衝液にてSfを 5倍稀釈したものを供試した .結果は第3表更にのとお注,Sf…7倍りである. 第3表鳥型竹尾株のSf, Pfのに稀釈せる溶液である. 表の如くSfは7倍脱水素能稀釈液を用いても対照のMb 還元速度は早く,各種基質添加時の還元速度も,対照速度と著差が観られなかつた.即ちSf自体に水素給与体となりうる物質が高度に含まれているものと考えられる. 次いでPfの脱水素能を検討するとcitrate以の基質は総て脱水素が観られたが,特 fumarate, Mb脱 succinate次色が起り,こているが,活 Pfの即ちSfは或る基質に対し特に脱水素能が強いという特性は余り見当らないが,中合高く,次いでfumarate, でもlactateは pyruvateの割順である. いでlactateが性度は之より更に強力に思われた.又対照も前記の供試株と異り長時間の観察で脱色が認められた. E) Myc, phleiの場合結果の大要は第5表に示した如くSfに試基質の総てに於て,又特にacetate, が観察された.しは対照と殆んど差を観な次いでPfの結果は前述の人型菌, BCGに比較し何れとも異つた興味ある性状を示した.即 succinate, malate, の基質に対し活性を示し,其 fumarate, euccinate, ち fumarateの4種 acetateに lactateの順であり,何れも還元於て質に対する特異的な脱水素能は観られなかつた. fumarate, malateに対しては比較的強い脱水素能が認められ, 之に次いでlactate, の脱水素能はmalate, 於ては供対照に於てもMbのかしpyruvate, は対照よりも脱色に長時間を要し,基い. Pfはlactate, 短時間での性状は鳥型菌と極めて類似し其の他の基質も脱水素は観られるが著明ではない. citrate等外にmatate, succinate, citrateの順であつた. 次にPfの性状を観ると, lactate, succinate, 5814 林 malate三周平 Rohner等17)に者のみを脱水素する.しかし其の脱水素より結核菌はかなり多くのri 能は強力なものではない.この性状は前述までの供 boflavineを試株の何れのPfの液及び之の透柝外液が螢光黄微色を呈すること,又酵素性状とも異つたものである. 有していることが知られた.菌銀による阻害が認められることから,脂第5表 Myc, phleiのSf. Pfの脱水酵素系にはriboflavineが素能体抽出肪酸脱水素関与することを山村8) は述べている. 著者はH37RaのSfがlactate, malateに対し強い脱水素能のあることを前述のとおり観察した. そこで之のSfを透柝処理し,其 lactate, 脱水素能を検討した. Co-factor malateのとしてはCoI, riboflavine, 度はColは1ml毎. 々, 100γ は前2日 II) A) 透柝処理せるH37RaのSfがlactate, malateの脱水素反応に及ぼすCo-factorの第6表緩衝液: 120γ 0.02mol per 即ちSfの H37Ra. phosphate ml, 100γ 透柝内液とlactateはは0.25mlとし,之論表中のNo れのCo-factorもたもの)で ml 各々0.5ml, pH ATP Mb 種々に組なるように緩衝液で補 1はCo-factorの含まない)での対照(lactateの solution per に上記Co-factorを合せ反応全量が2.35mlに正した.勿対照(何あり, Na. 8は代りに蒸溜水, 0.5mlを基質添加しある. 添加しなくてもNo. 2の添加するとMbの各溜水を外液とし後は1日1回液更新した. 基質とした場合反応の組合せ並びに結果は第6表 7.0, 100γ Mb: per 0.0002 mol lactate. ml*:lactateの代に示した. 添加した場合も全くNo. 2と同一の結果が得られた.又ATPをち対照と脱色時 CoI: 蒸溜水0.5ml 又著効を示したColとriboflavineを加しても(No. 5),単同時に添一添加の場合と何等反応速度に変りは認められない.勿論ColとATP (No. 6) 7)のような組合せ或はriboflavineとATP(No. も相助的効果は認められなかつた. 1のしかも補酵素としてColを脱色時間は著明に短縮される. 0.1mol, りに間に於て著差が認められない. れたことは,こ如くriboflavineを 1即 ATPは間透柝を実施した.外間は1日2回,以 lactateをえ存在すれ 3の 4)はNo. 内液とし,蒸の氷室内で1週如くColをしかしNo. 添加した場合(No. riboflavine, の濃のものを調製した. 以上の結果でNo. 結果は表中に観られる如くlactateさばCo-factorを用い,其 Sfの透析内液の乳酸脱水素反応に及ぼす諸因子の影響 buffer riboflavine. 影響 ATPを 120, 透柝処理法はSfをて2∼3℃ の内液につき組合せに於て脱色が観らの内液中に透柝処理に対して安定な, 如く思われる.こ必要としない系があるのことは楠瀬,山村等18) 19)が鳥型竹尾株より二種の乳酸々化酵素系を記載していることからも充分考えられる. 故に著者が検討した乳酸脱水素酵素反応は実際に抗酸性菌の物質代謝に関する研究はCoIを反応に必要とするものであるけれども, 反応系自体には二種の乳酸々化酵素系が不完全に存在したことは事実と思う. riboflavineはCoIと等の効果を見掛上は示したが,何同れの系に作用するかについては精製された段階に於て検討しない限り断言は許されない. B) malateを malic 5815 型菌の場合, CoIがPfに所有されていることを思わしめる. 然るに人型結核菌ではPfはて脱水素能を有せず,其全くmalateにの活性はSfにとも前述したとおりである. これ等の事実は少くとも,ある意味に於て菌体内基質とした場合における酵素の局在を現わす証拠であり,其の局 dehydrogenaseのCo-factorとしてCoI 在性の相違は細菌の種類によることを示している. が必要であることは以前より周知の事実である.山 Widman21), 村等14-16)は鳥型竹尾株の場合,其化の程度によることを報告している. 異的にmalateを対し存在するこのPfのみが特酸化することを観察しているし, Millman22)はそこで人型H 局在性の相違は細菌分 37 RaのSfを前述と全く同一の著者も鳥型竹尾株のPfはmalateに対し極めて強方法により透柝処理を実施し,其の内液がmalate 力な脱水全く微弱であに対して如何なる反応を示すかを検討した.其の結能を有しているが, Sfはることを前項で述べた.この事実は一面に於ては鳥第7表 H 37 Ra. malate: 実験方法はlactateを Sfの透析内液のmalateの 0.1mol,其基質として検討した場合と 8はるにNo. 2のも,或脱色は全く認められない.然反応系に加わると漸く脱かしそれには長時間を要した.又如くriboflavineのはNo. 対する対照基質に対する対照である.即如くCoIが色が起り得る.し No. 3の 1はCo-factorに全く添加しない場合は,例えmalate が存在してもMbの 4のと同一. た. 以上の結果を総合するとmalateの表中に於けるNo. ちCo-factorを脱水素に及ぼす諸因子の影響の他の内容は第6表全く同様である., であり,又No. 果は第7表に示した. みを反応系に添加して如くATPのみを添加しても, CoIは絶対必要なCo-factorでい.しかしCoIの之にriboflavineが脱水素にはあることに異論はなみでは其の活性は極めて弱く, 添加されると活性は著しく高められる.しかriboflavine自体ではmalateに対し活性は示されない. IV. 総括及び考按最近酵素化学の目覚しい進展は,其の終局の目的其の様な場合は全く脱色は認められなかつた. No. 5 である生合成の道を強く現わすに至つた. Green はCoIとriboflavineの等20)の主張は明かに細胞内に於ける酵素の局在性合であるが, CoIの Mb脱 ATPの CoIの両者を系中に添加した場みを添加せる場合の約1/2に色時間は短縮された.又No. 6はCoIと両者を添加したものであるが,こ効果のみ現われ, ATPはの場合は何等相助的効果をを代表するものと考えられる.かつて単純な意味で酵素標品として用いられた細菌細胞も其の目的が大きく異り,現在では細菌細胞の構造と,其の生理的意義が酵素化学により検討を受ける段階に至つた. 発揮するものではなかつた,又riboflavineとATP 病原微生物の限界に於てもこの方向は次第に高まりの両者を添加したものは全く脱色は認められなかっつつある.即ち免疫抗体は抗原的(殆んどの場合蛋 5816 林白が関与する)作れであり,之周用を受けた宿主の生体反応の現わに関してはHaurowitz等23-25)の詳平に稀釈されても対照のMb脱細な酵素学的基礎的研究がある.又Youmans等30) はcitrateをはH ,特 37 Raの不溶性顆粒分劃による感染防禦能を検討し優れた結果を得ている.最一門26-29)は人型結核菌 ,チ近,村上及び其のフス菌の超遠心,酵素色速度が早いため, 各基質に対する検討は非常に不明確である.又Pf 除き総ての供試基質で脱色が認められにmalate, fumarateにいでsuccinateに対しては非常に高く次対して高い活性を示し, lactate に中等度の活性を示したが, pyruvate, 活性分劃による感染防禦の詳細な検討を報告してい対するそれは弱いものである.又る. 対照で脱色が認められた. かくの如く菌体の酵素活性分劃が,免疫,感染防 5. Myc, phlei. 等抗原物質の酵素学的研対し幾分高く,次いでlactateに究は極あて重要である.そこで著者は岡11-12)31),滝るが, acetateは沢13)の一連の研究を更に抗酸性菌に拡大し,之等の菌体内の可溶性上清分劃と不溶性顆粒分劃の酵素の3者学的検討を意図し,本 malateに素反応を実施追求した.其の成績の大要を総括すると下記の如くである. 1. の総てでMbのいでlactateで fumarateにいでmalate, 又H あり, fumarate, 37 Rv, succinate, pyruvateの3者つた. pyruvateに H 37 RaのPfが株ともSfは共にlactate, のみしか脱水素しなか succinateに対する活性は遙かに強い結果を示した.又対照で脱色が観られるがPfで両は認められない. 2. 記の如く分劃せるものにつき其の性状を検討すると,同 BCGのSfはて脱水素能は弱い.あはfumarateの供試基質総てに対しる程度の高い活性を示したのみであつた.この点人型菌と可成異つた性状を示している.又Pfはlactate, の透柝内液にlactateを succinate 加え,こかし反応系中にCoIを添加すると脱色は更に短時間で起り得る.し riboflavineでかも之の反応はCOIを代用出来ることが判明した.結が,著者の実験段階でriboflavineのではmalateを内液はColの famarate, している.し BCGに pyruvateはかしPfの存在する反応系にriboflavineを CoIのみによる脱色よりも著しく時間が短縮される. しかしriboflavine単 fumarate, 中等度の活性を示脱水素能は前記人型菌, 性を示し,其 eucciaate, の内malateに人型菌,BCGで lactateの4者ちに活最も強い活性があり, 高い活性を示したlactateは最も弱い結果を得た. 4. Myc, ATCC. 独では何等脱色能力を保有しちriboflavineはCoIにＶ. 結人型結核菌, H 鳥型竹尾株, 種のsauton培菌のSfは対し相助作用を相当高度 37 Rv, Myc, ATCC. 養菌(Myc. 論 H 37 Rv,と 607, 次いでBCG, Myc. phleiは phleiの6 ブイヨン培養) を超遠心分劃法により可溶性分劃と不溶性顆粒分劃に別し,之 Raの等の酵素学的性状を追求し,更可溶性分劃を透柝処理し,其 lactate, 607:本添加すると, 脱水素能比して著しく性状を異にしている.即 palate, 存在なし CoIの照と比較して余り強力なものではないが, lactate, 作用機序を断脱水素することは不能である.又与え得る物質と考えられる. は,対核菌の乳酸々化酵素は二種存在することが知られているある. 基質に対するSfのの反応系にCo- 中に透柝に安定な乳酸々化酵素系の存在を思わしめる.しない.即鳥型菌:各 H37RaのSf 加しなくとも脱色が観られることは内液の両者のみ脱水素が認められ他の基質は全く陰性で 3. 性の強弱には性状: 言することは出来ない.又 BCG: じ抗酸性菌のグルー分劃の酵素分布,活透柝処理したSfの factor添対する活性は両者とも極めて微弱であり,又lactate, malate 完全細胞で其の細胞内の詳細の酵素性状を把握す 6. あつた. 両者のPfは succinate, 有意の差が認められる. 対して高い活性を示 pyruvateで H37Raの対し活性が存在す対しては弱い. プにあり乍ら,各対しても中等度の活性を示した. H37Ra のSfはlactate, し,次供試基質脱色が観られるが特にpyruvateに対して強く,次 malateに H 37 RvのSfは malateにに於てのみ脱色が観られるがsuccinate, ることは困難であるが,上人型結核菌: みが対照と何等差を認めることが出来ない. Pfはlactate, 編に於ては特にその脱水素酵本菌のPfの Sfはfumarate, 禦能と関係がある限り,之 pyruvate, acetateに malateの 37 の内液につき脱水素能をCo-factorのもとに検討し下記の結論を得た.検にH 存在の討方法は総て抗酸性菌の物質代謝に関する研究 Mb脱 6817 色法を用いた. の脱水素能は高められる.し可溶性分劃と不溶性顆粒分劃は明かに異つた COIの 1. かしriboflavineは代用にはならなかつた . 酵素性状を有する 2. 可溶性分劃の各基質に対する特異的活性及び活性の強弱は菌の種類により異る.このことは不溶稿を終るに臨み終始御懇篤なる御指導と御校閲を性顆粒分劃でもいえる. 3. H 37 Raの添加するとlactateに表します. 代用となる. 同じ透柝内液にCoIとriboflavineのを添加すると, COIの両者みによる場合よりもmalate 文 1) 川畑:福岡医誌, 2) Dubos, R. J.: 27, 833, Am. 1934 Rev. 献 17) . Tuberc., 60, 385, R. J. and Middlebrook, Tuberc., 4) Bloch, 58, 698, H.: Am. G.. Am. Rev. 66, 6) Patnode, C.: Rev. Tuberc., 61, Am. J., Fournier, E.: Rev. 382, Rev, 270, 207, Rev. Tu Tuberc., 療, C. 65, 山村,今津:医山村:酵素化学の進歩, 3, 10) 大林,続木,古 187, 屋:医 9, 22) 1954. and Fish, C. H. 山医学会誌, 69, 5, 1229,昭和32. 山医学会誌, 69, 5, 1239,昭和32. 13) 滝沢:日本細菌学会,中光市.昭和32. 楠瀬,永井,山 al.. 16) Med. 山村:結 J. Osaka. Univ., 核菌の生化学,共 Nagai, 29) 村上,松 30) Youmans, 6, 立出版, 489, 132,昭 27, 247, 1952. J. 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And then, the author picked out the soluble fraction of H 37 Ra; dialyzed it and studied the dehydrogenase activity of the dialyzed soluble fraction for lactate and malate with the addition of Co factor by means of Thunberg's methylen blue reduction method. The following results were obtained. 1) It was observed that the enzyme activities of two fractions, soluble and particulate, were distinctly different in any organisms. 2) It could be comfirmed that the specilic enzyme activity of each fraction for ehe substrates and the intensities of that activities were varied as the strains. 3) The dehydrogenase activity of the dialyzed soluble fraction of H 37 Ra for lactate was raised by the addition of CoI. And riboflavin could substitute for CoI. 4) The more increased dehydrogenase activity for malate was observed by the simul taneous addition of GoI and riboflavin to the dialyzed soluble fraction of H 37 Ra compaired with the single addition role of CoI. of CoI to that fraction. However riboflavin failed to replace the