遊佐光伸（M1 - School of Science and Technology, Kwansei Gakuin

構造変化の時間スケールから見て、変性タンパク質は
均一の状態にあるか
Is the denatured state of protein homogeneous in terms of
the time scale of conformational interconversion.
○遊佐光伸1、野田康夫1、橘秀樹2、瀬川新一1
○Mitsunobu Yusa1、Yasuo Noda1、Hideki Tachibana2、Shin-ichi Segawa1
（1関学大・理工、2神戸大・理）
1: School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University
2: School of Science, Kobe University
Introduction
タンパク質の折りたたみ反応を研究するために、S-S結合を欠損させた様々なニワトリ・リゾチームを作
製し、NMRによってその構造を残基レベルで解析してきた。S-S結合を欠損させることによって非天然状
態になったタンパク質に残る部分秩序構造を、主鎖アミドプロトンのH-D交換反応によって調べてきた。
これまでの研究において、2SS[64-80,76-94]変異体 (2SS(3+4)と略称) はランダムコイルに近い非
天然状態であることがCDスペクトルやHSQCスペクトルからわかっている。しかし、30% Glycerolを添加
すると 2次構造量が顕著に増大することがFar-UV CDスペクトルからわかっている。どの残基領域に変
化が生じたのかをH-D交換反応から求まるProtection Factor (P.F.) で解析した。
P.F.は残基54-58領域（特にI55,L56とβ3ストランド）とA、B、CヘリックスのI55 & L56に近接した領域で
顕著に増大する。一方β1、2ストランド付近の多くの残基において、2つの交換速度があることを見出した。
1つは反応初期に素早く交換するものと、もう1つは交換速度の極めて遅いものであった。
原因の一つとして、Glycerol中で分子間の非可逆な凝集体を形成する可能性が考えられる。その可能性
を検討するために、CDスペクトルの経時変化を調べたり、またGlycerol濃度の希釈後CDスペクトルが可逆
的に元に戻るか実験を行った。その結果、Glycerolによる状態変化が可逆的であることがわかった。また、
4M グアニジン塩酸塩（GuHCl）溶液中で完全にランダムコイル化した状態から30％Glycerol溶媒条件に変
化させてH-D交換反応を追跡する実験を行った。
CD spectra of 2SS(3+4) in 30% Glycerol at pH3
-2000
150
(a)
100
[θ] [deg.cm2.dmol-1]
[θ] [deg.cm2.dmol-1]
0
-4000
-6000
0% Glycerol
-8000
30% Glycerol
-10000
(c)
50
0
-50
Wild Type Lysozyme
2SS(3+4) in 30% Glycerol
2SS(1+3)
2SS(1+3) in 30% Glycerol
-100
-150
-12000
210
220
230
240
250
wavelength[nm]
[θ] [deg.cm2.dmol-1]
0
-2000
-200
260
270
280
290
300
310
wavelength [nm]
(a) Far-UV CD of 2SS(3+4) at pH 3 and 4℃
(b)
(b) Far-UV CD of 2SS(3+4) in 30% Glycerol at
pH3 and 4℃
-4000
-6000
4℃
10℃
15℃
20℃
25℃
30℃
40℃
60℃
-8000
-10000
(c) Near-UV CD of 2SS(3+4), 2SS(1+3), and
Wild Type Lysozyme
7℃
12.5℃
17.5℃
22.5℃
27.5℃
35℃
50℃
30％Glycerolを2SS(3+4)に加えることによって、2次
構造は増加するが、3次構造は変わらない。
-12000
210
220
230
wavelength[nm]
240
250
Protection factor of 2SS(3+4)
in 30% Glycerol at pH 3.0 and 4℃
Protection Factor
100
10
1
0
20
40
60
80
100
120
Residue Number
P.F.を求めるためのH-D交換反応の実験方法は後ろのページで示してある。
Correlation between secondary structure
and regions where P.F. increased
1
70
P
T
G
N
C
76
P
L
N
G
A
64 C
I
Y
T
129
W
N
D
N
L
W
S
T
R 45
I
60 50 S
N
G
T
S
85
S
T
D
90
N
A
I
S
W
94
120
D
A
M 105
I
A
30
T
G
K
W
K
C
L 25
G
N
K
V
Y
A
V
R
S
D
G
N
100
Large P.F. regions
A-helix, B-helix, C-helix, β310, end of β2 to β3
A
110 A
N
A
W
115
R
N
V
G
V
G
Q
G
D
A
20
S
V
35 E
A 127
R
W
A
F
A
I
Y
H 15
K
R
N
R
A
N
L
L
10
D
L
F
40
Q
R
A
S
S
N
C
S
T
G
K
A
E
Q
I
M
L
6
55
D
N
80
G
R
R
L
F
V
R
G
S
K
R
P.F. ＞ 10
P.F. ≒ 1
fast + very slow
Change in peak volumes of HSQC spectra
8x107
5x107
7x107
A42
T43
6x107
4x107
5x107
3x107
4x107
3x107
2x107
2x107
1x107
1x107
0
0
0
10000
20000
30000
40000
0
50000
10000
20000
30000
40000
50000
6x107
6x107
5x10
N44
7
R45
5x107
4x107
4x107
3x107
3x107
2x107
2x107
1x107
1x107
0
0
10000
20000
30000
40000
50000
0
0
10000
20000
30000
40000
50000
β1、2領域残基のピーク体積の反応時間変化を示した。これらは2つの相を持っていて、反応初期の速い相と
ほとんど変わらない極めて遅い相である。凍結乾燥させたサンプルを溶解後、すぐに反応するものと極めて遅
い2種の状態が存在していると考えられる。
(A)
2000
Time course of the state forms partially
ordered structure
[θ] [deg.cm2.dmol-1]
0
-2000
-4000
-6000
immediately
after dissolved
12 hours
2 days
3 days
7 days
-8000
-10000
-12000
-14000
210
220
230
240
250
wavelength [nm]
Time course of ２SS(3+4) in 30% Glycerol at pH 3 and 4℃ monitored by Far-UV spectrum.
7日経過してもスペクトルはほとんど変わっていない。この条件下で構造に大きな変化
は現れていない。
(B)
Reversibility of form partially ordered structure
2000
[θ] [deg.cm2.dmol-1]
0
-2000
2SS(3+4) was initially
dissolved in 30%
Glycerol at pH3 and 4℃.
After several days, this
sample solution was
diluted in
concentrations of
Glycerol and protein by
adding buffer solution.
Then Far-UV CD
spectra were measured.
-4000
-6000
-8000
immediately after dissolved
1 day
2 days
4 days
7 days
-10000
-12000
-14000
210
220
230
240
250
wavelength [nm]
長時間30%Glycerol中に置いても、希釈することによってCDスペクトルは元のGlycerolのない状態
に可逆的に戻る。つまり、30%Glycerol中で生じているj状態変化は可逆的な分子内反応であると考
えられる。
Material and Method of H-D exchange reaction
4M GuHCl with
100% H2O,
200μl
33% Glycerol
with 100% D2O,
1800μl
H-D exchange
reaction with
90% D2O
C8 Sep Paｋ column
4℃,pH3.0
①pour in D-sample
②flow D2O to
remove Glycerol
and GuHCl
Freeze-dried
sample 1mg
4℃ pH3.0
NMR solvent
(95%DMSO, 5%D2O)
NMR
measurement
(HSQC)
Freeze dry to
stop reaction
③dissolve out
sample with 60%
Acetonitrile
Change in peak volume of HSQC spectra
1.0x108
7x107
A42
6x107
T43
8.0x107
5x107
6.0x107
4x107
3x107
4.0x107
2x107
2.0x107
1x107
0.0
0
0
10000
20000
30000
40000
0
50000
10000
20000
30000
40000
50000
9x107
7x107
R45
8x107
N44
6x107
7x107
5x107
6x107
4x107
5x107
3x107
4x107
3x107
2x107
2x107
1x10
7
1x107
0
0
0
10000
20000
30000
40000
50000
0
10000
20000
30000
40000
50000
β1、2領域残基のピーク体積の反応時間変化を示した。４M GuHClでランダムコイル化したサンプルでも、
30% Glycerol状態にすると遅い交換反応相が依然観測され、2つの分子状態が存在している。
Difference in protection factors between 2SS(3+4) and 0SS-variants
Red line:
2SS(3+4)
Protection Factor
100
Green line:
0SS
10
1
0
20
40
60
80
100
120
Residue Number
0SS変異体ではP.F.がほとんど1.0であった。Glycerolの効果はほとんどない。それに対して、２SS(3+4)変
異体では、I55、L56の周りとA、BヘリックスのP.F.が大きく増大している。Β310へリックスからCへリックスの
Ν端領域もP.F.が増大している。

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