認知症の早期発見、予防・治療研究会 2015年3月29日 マウス記憶障害モデルに対する日本産 トウゲシバ (ヒューペルジア) の作用 原 英彰、大庭 卓也 岐阜薬科大学 生体機能解析学大講座 薬効解析学研究室 内容 ・トウゲシバとは？ ・トウゲシバの利用 ・トウゲシバの成分 ・実験結果 ・まとめ 内容 ・トウゲシバとは？ ・トウゲシバの利用 ・トウゲシバの成分 ・実験結果 ・まとめ トウゲシバ ・学名 : Huperzia serrata - 和名 (峠柴) は峠付近に生える草という 意味で名がつけられたと言われている ・ヒカゲノカズラ科に属するシダ植物 - 代表的なシダ植物には、食用にするワラビ、 ゼンマイがある。 トウゲシバ http://plants.minibird.jp/kansai/kansai50/kansai_ta/con_to/tougesiba/tougesiba.html ワラビ http://had0.big.ous.ac.jp/plantsdic/pteridophyta/de nnstaedtiaceae/warabi/warabi.htm トウゲシバの特徴① ・冬でも枯れない常緑の多年草であり、1年中見つけることも可能 ・茎は根元から枝分かれして斜めに立ち上がるように成長する ・成長すると10~20 cm の高さになる ・低地～山地のやや湿った森林の 地表面に生育する トウゲシバの特徴② ・トウゲシバの葉は変異が大きく、 幅は1~5mm ・先は鋭く、縁は不整な鋸歯のような 形をしている ・胞子嚢 (腎臓のような形) を持 ち、 胞子で繁殖する トウゲシバの特徴③ 無性芽 ・栄養繁殖も行い、茎の上部に生じる 無性芽が外れて地面に落ちると、 新しい植物になる トウゲシバの分類 ・葉の広さにより3種に分類される http://mikawanoyasou.org/sida/hosobatougesiba.htm ホソバトウゲシバ (2mm以下) http://mikawanoyasou.org/sida/hirohanotougesiba.htm ヒロハノトウゲシバ (2-3mm) http://koma33.web.fc2.com/onitougesiba.html オニトウゲシバ (3-5mm) 区別が難しく、3種をまとめてトウゲシバとすることが多い トウゲシバの分布 ・海抜300~2700mに分布している ・日本では、ほぼ全土に分布している ・朝鮮、中国、東アジア、東南アジア にも分布していると考えられている 内容 ・トウゲシバとは？ ・トウゲシバの利用 ・トウゲシバの成分 ・実験結果 ・まとめ 生薬としての利用 だそくせきしょう せんそうとう ・中国では蛇足石松、千層塔と呼ばれ伝統的に利用 ・リウマチ、風の治療、筋肉や腱の弛緩、血液循環の 改善に有効 ・打撲、筋挫傷、腫れの治療にも有効 ・近年では、有機リン酸中毒、重症筋無力症、統合失調症にも 用いられている。 サプリメントとしての利用 ・1980年代後半にトウゲシバ中の成分が、 記憶や学習に良いことが発見された。 ・アメリカでは、記憶を良くするサプリメ ントとして、トウゲシバが使用されている。 ・日本国内においてもトウゲシバのエキスが 配合されたサプリメントが販売されている。 (レキオファーマ(株)、(株)皇漢薬品研究所 など) 内容 ・トウゲシバとは？ ・トウゲシバの利用 ・トウゲシバの成分 ・実験結果 ・まとめ 主な成分 トウゲシバ アルカロイド フラボン トリテルペン フェノール酸 主な成分 トウゲシバ Me 単離 アルカロイド H N Me H2N Huperzine A O Huperzine A の作用 ・1986年に、初めて単離された物質 ・アセチルコリン分解酵素 (Acetylcholinesterase; AChE) 阻害作用 http://www.falcon18.com/health-blog/Best-Ingredient-And-Herbs/To-KnowAbout-Huperzine-A/Benefits-and-Advantages-of-Huperzine-A.html 分子量：242.32 半減期：約5時間 Rui Wang et al. 2006 Progress in studies of huperzine A, a natural cholinesterase inhibitor from Chinese herbal medicine. Acta Pharmacologica Sinica. 27 1-26 ・NMDA型グルタミン酸受容体阻害作用 D. L. Bai et al. 2000 Huperzine A, A Potential Therapeutic Agent for Treatment of Alzheimer’s Disease. CurrentMedicinal Chemistry. 7 355-374 が主に知られてい る。 Huperzine A の作用 (構造の類似性) ドネペジル メマンチン Huperzine A メマンチンの2つのメ チル基がNMDA受容 体阻害に重要である。 ガランタミン 芳香環がAChEの活性部位で相互 作用し、立体構造を変化させる。 Huperzine A の作用 (構造の類似性) http://bidd.nus.edu.sg/group/images/full_ acetylcholinesterase.gif Walrati et al. 2013. Key Binding Interactions for Memantine in the NMDA Receptor. ACS Chem Neurosci. 4. 255-260 http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1VOT Huperzine Aの作用 前炎症性サイトカインであるTNFα、IL-1β、IL-6の発現を低下 させ、抗炎症性サイトカインであるIL-10の発現を上昇させ Ruan et al. 2013. The anti-inflamm-aging and hepatoprotective effects of huperzine A in D-galactose-treated rats. Mech Ageing Dev. 134, 89-97 た。 てんかん、てんかん重積に対して保護作用を示した。 Coleman et al. 2013. [+]-Huperzine A treatment protects against N-methyl-D-aspartate-induced seizure/status epilepticus in rats. Chem Biol Interact. 25, 387-95 抗炎症、抗けいれん作用の報告もある。 Huperzine Aの作用 老齢のサルにおいて、記憶改善作用を示した。 Jia Wei Ye et al. 1999. Improving Effects of Huperzine A on Spatial Working Memory in Aged Monkeys and Young Adult Monkeys with Experimental Cognitive Impairment. JPET. 288, 814-819 アミロイドβ誘発の酸化的障害に対して、保護的に 働く。 Xiao Qiu Xiao et al. 2000. Protective effects of huperzine A on β-amyloid25–35 induced oxidative injury in rat pheochromocytoma cells. Neuroscience Letters. 286, 155-158 ヒト軽度のアルツハイマー病において、認知機能のスコア を改善した。 M.S. Rafii et al. 2011. A phase II trial of huperzine A in mild to moderate Alzheimer disease. Neorology. 19, 1389-1394 新たなアルツハイマー病の治療薬候補として、アメリカ、 中国を中心に研究が行われている。 アルツハイマー病 ・認知症の最も一般的な原因の一つ で、 認知症の原因の約70%を占める。 ・アミロイド斑形成と神経原線維変化が 主な特徴である。 ・神経細胞の脱落によって脳の委縮が 起こる。 http://dementia.seesaa.net/article/9904753.html 神経伝達の低下、痴呆を生じる。 脳での情報伝達 シナプス前膜 神経伝達物質 シナプス後膜 神経情報の伝達 http://www.jst.go.jp/pr/info/info517/zu1.html アセチルコリンと脳機能 加齢 アルツハイマー病 など アセチルコリン アセチルコリン量 の低下 脳内の神経伝達物質の1つで、 行動、学習、記憶に関係する 脳機能が低下する原因 とされている。 アセチルコリンと脳機能 コリン 分解 酢酸 アセチルコリン AChE Huperzine A Rui Wang et al. 2006 Progress in studies of huperzine A, a natural cholinesterase inhibitor from Chinese herbal medicine. Acta Pharmacologica Sinica. 27 1-26 アセチルコリンと脳機能 AChEの働きが阻害されることで、アセチルコ リンの分解、アセチルコリン量の低下を防ぐ 脳機能の低下を抑える 現在日本で市販されているアルツハイマー病 治療薬 形状 飲み薬 (錠剤) 貼り薬 商品名 一般名 適用 1日薬価 (2013年 8月時点) アリセプト ドネペジル塩酸塩 軽度～重度 238.5 ~ 636.0 円 レミニール ガランタミン 臭化水素酸塩 中等度～重度 209.4 ~ 474.2 円 メマリー メマンチン塩酸塩 軽度～中等度 133.9 ~ 427.5 円 イクセロンパッチ リバスタッチパッチ リバスチグミン 軽度～中等度 337.2 ~ 427.5 円 赤; AChE阻害作用を持つ薬 青; NMDA受容体阻害作用を持つ薬 内容 ・トウゲシバとは？ ・トウゲシバの利用 ・トウゲシバの成分 ・実験結果 ・まとめ 研究の目的 ・岐阜県山県市産のトウゲシバにはどの程度 Huperzine Aが含まれているのか？ ・岐阜県山県市産トウゲシバの抽出物に記憶改善 作用がみられるか？ トウゲシバ成分の抽出 ・左図のようにトウゲシバを 分画した。 ・Alkaloidal enrich fractionを トウゲシバエキスとして使用 した。 トウゲシバ中のHuperzine A含有率 ・岐阜県山県市産のトウゲシバを 使用 ・山県市産のトウゲシバ 1 kg あたり、 Huperzine A が約 50 ㎎ 含まれて いた。 岐阜県山県市産のトウゲシバの Huperzine A 含有率は0.5%であった。 トウゲシバ中のHuperzine A含有率 愛知県犬山市産のトウゲシバでも同様にアルカロイドの 抽出を行ったところ、10分の1程度の収率であった。 産地や気候条件によっては含有成分に違いが見られる 可能性が高い。 トウゲシバエキスのAChE活性に対する作用 ・実験プロトコール 30 min Samples Test drugs 20 min Acetylcholine reaction mixture Measuring absorbance ・マウス脳ホモジネートを AChE 酵素試料として使用した。 ・Control群の活性割合を100%とし、被験薬添加による 活性割合の変化を指標とした。 トウゲシバエキスのAChE活性に対する作用 ・トウゲシバエキスは AChE の活性を 濃度依存的に阻害し た。 ##; p < 0.01 vs. control (Student’s t-test). **; p < 0.01, *; p < 0.05 vs. control (Dunnett’s test). トウゲシバエキスの BuChE 活性に対する作用 ブチリルコリンエステラーゼ (Butyrylcholinesterase; BuChE) ・実験プロトコール 5 min 1 min 1 min 30 min Samples Test drugs Color reagent Substrate solution Measuring absorbance ・マウス血清を BuChE 酵素試料として使用した。 ・Control群の BuChE 活性割合を100%とし、被験薬添加による 活性割合の変化を指標とした。 ・トウゲシバエキスの濃度は、AChE 活性測定と同様の濃度を 用いて検討を行った。 トウゲシバエキスの BuChE 活性に対する作用 ・トウゲシバエキスは BuChE の活性を阻害しなかった。 ・トウゲシバエキスはAChEに 高い選択性を示したと考えら れる。 記憶障害モデルマウスの作成 ムスカリン性の抗コリン薬として知られ ている。 マウスに投与することで中枢神経系を http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/poison/higher_det_11.html スコポラミン 抑制し、記憶障害を誘発する。 簡便な方法として、認知症モデル 作成に広く用いられている。 Y字型迷路試験 ・マウスを3本のアームからなる装置内 を探索させ、自発的交代行動を短期記 憶として評価する方法 ・測定時間内に各アームに侵入した回数 及び連続して異なる3本のアームに侵 入した組み合わせの数を調べる ・交代行動率を算出し、短期記憶の指標 とする 交代行動率 (%) = 交代行動数 ÷ (総アーム侵入数 – 2) × 100 記憶障害モデルマウスに対するトウゲシバエキス の効果① ・実験プロトコール 5 days Y maze test 1 day 1日1回トウゲシバエキスをマウスに経口投与 6日目にY字型迷路試験 (Y maze test) を行った。 : scopolamine (3 mg/kg) i.p. : トウゲシバ (30 mg/kg) or 0.5% CMC p.o. 記憶障害モデルマウスに対するトウゲシバエキス の効果① ・トウゲシバエキスは正しい アーム交代行動を増加させ た。 ・マウスの記憶が改善された。 ##; p < 0.01 vs. control (Student’s t-test). *; p < 0.05 vs. vehicle (Student’s t-test). 受動回避試験 ・マウスが暗い場所を好むことを 利用した試験 ・訓練試行では、明室へ入れたマウスが 暗室内へ移動すると扉を閉め、電気刺 激を与える ・訓練試行の一定時間後、再びマウスを 明室に入れ、暗室への移動時間を 記憶の指標とする 記憶障害モデルマウスに対するトウゲシバエキス の効果② ・実験プロトコール 4 days Passive avoidance test habituation stimulation 1 day 1 day 1日1回トウゲシバエキスをマウスに経口投与 5~7日目に受動回避試験 (passive avoidance test) を行った。 test 1 day : scopolamine (3 mg/kg) i.p. : トウゲシバ (30 mg/kg) or 0.5% CMC p.o. 記憶障害モデルマウスに対するトウゲシバエキス の効果② ・トウゲシバエキスは マウスの暗室への侵入時間を 上昇させた。 ・マウスの記憶が改善された。 ##; p < 0.01 vs. control (Student’s t-test). **; p < 0.01, *; p < 0.05 vs. vehicle (Student’s t-test). Open Field試験 ・新奇環境下での自発的な活動性を測定する テスト ・マウスにとって新奇で広く明るい環境で あるオープンフィールドの中にマウスを 入れ、一定時間自由に探索させる ・マウスの移動距離を、自発活動量の指標 とする 記憶障害モデルマウスに対するトウゲシバエキス の効果③ ・プロトコール 7 days 1日1回トウゲシバエキスをマウスに経口投与 8日目にOpen Field試験を行った。 1 day : scopolamine (3 mg/kg) i.p. : トウゲシバ (30 mg/kg) or 0.5% CMC p.o. 記憶障害モデルマウスに対するトウゲシバエキス の効果③ ・トウゲシバエキスはマウス の自発活動量を変化 させなかった。 ・記憶の改善は、行動変化の 影響によるものでは なかった。 ##; p < 0.01 vs. control (Student’s t-test). 内容 ・トウゲシバとは？ ・トウゲシバの利用 ・トウゲシバの成分 ・実験結果 ・まとめ まとめ 1/4 山県市産のトウゲシバエキスは、 Huperzine Aを0.5%含有していた。 - 過去の報告における含有率は、約0.02%以下という Ferreira et al. 2014. Huperzine A from Huperzia serrata: a review of its sources, 報告がある。Ana chemistry, pharmacology and toxicology. Phytochem Rev. 13. AChE活性阻害作用を示した。 BuChE活性阻害作用を示さなかった。 まとめ 2/4 山県市産のトウゲシバエキスは、 Y字型迷路試験において、マウスの記憶を改善した。 受動回避試験において、マウスの記憶を改善した。 マウスの自発活動量を変化させなかった。 まとめ 3/4 成分名 50% AChE活性 阻害濃度 サプリメント又は薬 剤に含まれている量 1日摂取量 Huperzine A 約 90 nM 26 µg 約 100 nM/日 ドネペジル 約 50 nM 3 ~ 10 mg 約 10 ~ 30 µM/日 差 (D/HA) 0.56 115 ~ 384 100 ~ 300 まとめ 4/4 アルツハイマー病 治療薬 サプリメント Jack CR Jr et al. 2010 Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer’s pathological cascade. Lancet Neurol 9, 119-28. 結語 日本国岐阜県産トウゲシバ抽出物は、認知機能障害の 関わる疾患の予防に有用である可能性が示唆された。 謝辞 ・順天堂大学大学院認知症診断・予防・治療学、河村病院もの忘れ外来 田平 武 様 ・岐阜薬科大学 機能分子学大講座 生薬学研究室 阿部 尚仁 様、大山 雅義 様 ・岐阜薬科大学 生体機能解析学大講座 薬効解析学研究室 吉野 雄太 様、 石坂 光絵 様、鶴間 一寛 様、 嶋澤 雅光 様 ・河村病院 櫻井 勲 様 ・レキオファーマ(株) 横山 宗明 様
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