最終報告書工 K−1671 の微生物等による分解度試験（試験番号BO2009）広栄テ株式会社信頼性保証報告書 1．試験の種類｝ 2．試験 N o．B O2009 3．被験物質の名称 1，2一ベンゾチァゾリンー3一オン本試験は、「新規化学物質に係る試験及び指定化学物質に係る有害性の調査の項目等を定める省令第4条に規定する試験施設について」（平成12年3月1日：環保安第41号、生衛発第268号、平成i2・02・14基局第1号改正）（平成13年1月24日：医薬発第43号、平成13・01・23製局第1号、環保企第13号一部改め）（化学物質GL P）に従って適正に行われており、最終報告書には、試験で使用した方法および手順が正確に記載され、報告結果は、試験の生データを正確に反映していることを保証する。なお、当施設で定めた信頼性保証業務標準手順書による監査・査察の状況は下記の通りである。記日日日32 月月月 00 年11 年年施22 00 実00 22 対象試験計画書確認試験施設査察（実験前査察）試験の実施状況監査・査察報告年月日 2002年10月 3日 2002年10月 3日監査及び査察（B O D試験開始日）監査及び査察（B O D試験終了日） 2002年10月 3日 2002年10月31日 2002年10月31日 2002年10月 3日最終報告書監査 2002年12月 6日 2002年12月 6日備考：信頼性保証業務担当者■■幽異動‘こよ彊■■■に変更した。（20・2．11．1付）ヌ加Z年／之月 6日信頼性保証業務担当者所属広栄テクノサービス株式会社職信頼性保証チームメンバー試験No．BO2009 表題：K−1671の微生物等による分解度試験試験期間自：2002年10月 3日至：2002年12月6日試験委託者の名称と所在地財団法人化学物質評価研究機構福岡県久留米市中央町19番14号試験機関の名称と所在地広栄テクノサービス株式会社大阪市城東区放出西2丁目12番13号 200ユ年12月6日試験責任者氏名（安全性試験グルー試験担当者氏名（分解度試験）最終報告書作成者名最終報告書作成年月日 ZOO2年1ユ月6日 KOE1TECHNOSERVTCE 試験No．BO2009 目次 123456789αLL＆全乳E 試験材料および試験方法一採用した試験方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一被験物質一一一一一一一一一一一一−一−巴一一一一−昌一『一一一一一i 対照物質一一一一一一一一F一一一一一一−一曹層¶昌昌昌昌昌一一一一一試薬一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一使用生物一一一一一一一一一一一一一一一一一『骨督−一一昌一一一一『一試験装置一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一試験条件一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一試験濃度一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一暴露試験期間一一一一昌一昌一昌−一−一−昌一一『−一一−一一昌−一一一観察、測定、検査及び分析の種類と頻度一一一一一一一一一一一一一一一一被験物質の残留量測定法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一丁OC測定法一一一一一一一一一一一一一一‘一『ロー一甲一『層署−一一データの解析に使用した統計学的方法等一一一一一一一一一一一一一一一準拠したGLP 一一一一一一一一一『一『−一一酷暑−一戸一一一一一督』試資料の保管一一一一一一一一一一一一一一一＿一一＿＿一一一＿一一一一試験成績の信頼性に影響を及ぼしたと思われる環境要因一一一一一一一一一一試験結果 1、試験条件の確認一一一一一暑一一一一一一一『一，一一一一一−福引一一− 2．残存率及び分解度一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 3．残留丁OC量一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 4，暴露試験中及び暴露試験終了後に実施した観察及び測定一一一一一一一一一 5．被験物質の物質確認及び保管条件下に於ける安定性確認一一一一一一一一一考察結論付表付図 4 4 6 緒言一一一一一一一一一一 − −トー−−−−2233乳44444卜55566677 工試験の目的及び試験結果要約 7 KOE［TECHNO SERVICE 試験 No ‐B02009 試験の目的及び試験結果要約既存化学物質 K-1671 の安全性評価の一環として、微生物分解性を調べるために環保業第5号 ,薬発第 615号,49基局第392号 <微生物等による化学物質の分解度試験 > に基づいた方法で分解度試験を行った。その結果、本試験条件下における28 日後の酸素消費量による分解度は、平均一7% であった。直接定量によるK 一 1671 の残存率は、被験物質分解 11;平均 100% 、被験物質 - 水区 :100% であり、分解度は、平均 -1% であった。全有機炭素残存率は、被験物質分解区 ;平均 120% 、被験物質 ‐水区 ;102% であり、分解度は、平均 -17% であった。以上の結果より、K ‐ 1671 は、本条件下において微生物等により分解され難いと考えられる。なお、アニリンの分解度は、暴露試験開始 7日後で 52% であったので本試験は有効である。緒言既存化学物質 K ‐ 1671 の安全性評価の一環として微生物分解性を調べるために分解度試験を実施した。試験材料および試験方法 1,採用した試験方法環保業第 5号 ,薬発第 615 号,49基局第 392 号 <微生物等による化学物質の分解度試験 > に基づいた方法で分解度試験を実施した 2. 被験物質名別称名 Cas No ‐ . :12ヘンゾチァゾリン-3」オン : K-1671 : 2634 構造式 : 分子式分子量 : C,H5NOS : 151.19 L 。t .. No 純・度 : ・ ‐ 33 ‐ 5 0 100.0% 外観・形状 : 微黄色粉末保管条件 : 冷暗所同定安定性 : 試験施設測定 MS 、NMR( 試験計画書に添付 )及びIR(付図4)スペクトルにて同定 : 保管条件下 ;暴露試験開始日積i定IRスペクトル {付図 5)と暴露試験終了日測定 IRスペクトル (付図 6)の比較によって安定であることを確認。試験条件下:分解度試験のためすく要 KOBI TECHNO SERV ーCE 試験No．BO2009 3．対照物質名称：アニリン構造式 N H1 ◎ 分子式：C6H7N 分子量二93．13 Lot No．：SL−3234W メーカー純度：99％ 4．試薬石津製薬製試薬特級りん酸二水素カリウム石津製薬製試薬特級りん酸水素ニナトリウム12米塩石津製薬製試薬特級塩化アンモニウム石津製薬製試薬特級硫酸マグネシウム7水塩石津製薬製試薬特級塩化カルシウム石津製薬製試薬特級塩化第二鉄6水塩石津製薬製試薬特級ソーダライムキシダ化学製二酸化炭素吸収用フタル酸水素カリウム石津製薬製試薬特級炭酸ナトリウム石津製薬製試薬特級炭酸水素ナトリウム石津製薬製試薬特級アセトニトリル、りん酸水素ニカリウムキシダ化学製液体クロマトグラフ用りん酸二水素ナトリウム2水塩石津製薬製試薬特級水酸化ナトリウム石津製薬製試薬特級 5．使用生物活性汚泥1財団法人化学物質評価研究機構化学物質安全センターより2002年9月25日に入手した標準活性汚泥を当試験室で温度25±2℃、溶存酸素5mg／L以上、pH7．0±1．0で培養管理した ∼弓泥（才弓泥No．140925）活性汚泥の懸濁物質濃度測定結果（2002年10月2日）：5483mg／L 6．試験装置クーロメータ：大倉電気製OM−2001A型データサンプラー：旭テクネイオン製DS−3 7．試験条件試験温度：25．0∼25．1℃ 試験液量：300mL 試験水lll本ミリポア製超純水製造装置によぐ自製 2 KOEITECHNOSE二RVICE 試験No．BO2009 8，試験濃度汚泥懸濁物質濃度 30mg／L 被験物質濃度：100mg／L 9．暴露試験期間 28日間（2002年10月3日∼2002年10月31日） 10、観察、測定、検査及び分析の種類と頻度温度，被験物質の溶解状態，試験液の色，汚泥の増殖状況観察：1日1回観察（但し、休日合計9日間を除く）酸素消費量の測定：クーロメ一夕による28日間連続自動測定試験液のpH測定：試験終了後、クーロメータより取り出した直後に測定被験物質の残留量測定：試験終了後、試験液を前処理して液体クロマトグラフィー（LC）により分析全有機炭素（TOC）量の測定：試験終了後、試験液を前処理してTOC分析装置により分析 11．被験物質の残留量測定法、 11．1直接定量の前処理基礎呼吸区、被験物質分解区及び被験物質一水区試験液300mL pH測定試験液スターラーで撹拌しながら駒込ピペットで採る。約50mL 遠心分離（4100rpm，5min）沈殿上澄 TOC分析 LC分析 112液体クロマトグラフ分析条件装置一：日立製作所製L−7000システム検出器：日立製作所製UV検出器D−7420 データ処理装置：日立製作所製D−7000 カラム：L−columnODS5μm4．6mmφx150mm カラム温度：40℃ 移動相 1アセトニトリル／10mmolりん酸二水素ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウムにてpH7に調整）ニ15：85（v／v）流量：LOmL／min 波長二240nrn 感度＝1AUFS 注入量：10．0μL 〈標準液の調製＞ K−1671濃度として16．8∼167．7mg／しの間で4点となるように水で希釈したものを標準液とした。 11．3定量限界定1量限界（確認済）二1．Omg！L〔了・備試験試験No．BO2009−1より） 3 KOEITECHNOSERViCE 試験No．BO2009 11・4添加回収率（予備試験試験No．BO2009−1添加回収試験結果より）被験物質分解区：101％被験物質一水区：101％添加回収試験の結果より、試験終了液の直接定量による残存率及び分解度は回収率100％として算出した。 12．TOC測定法 12．1分析試料の前処理 1L1に示した前処理液を使用した。 12，2TOC分析条件装置：島津製作所製丁OC−5000A ra㎎e ：X5 注入量：TC；20μL，IC l25μL 触媒：TC触媒キャリアーガス：空気工流量：150mL／min 〈標準液の調製＞ ①TC用標準液：フタル酸水素カリウム0，21252gを正確にはかり、水で100mしにメスアップした。これを、更に水で10倍希釈したものを標準液とし蔦（100．Omg／L TC溶液） ②I C用標準液：炭酸水素ナトリウム0、35099g、炭酸ナトリウム0．44254gを正確にはかり、水で100mL にメスアップした。これを、更に水で10倍希釈したものを標準液とした。（100．3mg／し IC溶液） 13．データの解析に使用した統計学的方法等・LC分析検量線の回帰式ならびに回帰係数は・最小二乗法により算出した。・TOCのデータ処理は、分析計に付属するデータ処理装置で行った・・被験物質添加量、被験物質残留量、TOC残留量（質量二mg，濃度二mg／L）及び酸素消費量（質量二mg）は、小数点以下一桁に丸め、残存率、分解度（％）は、整数に丸めて表示した。・数値を平均する場合は、算術平均とした。・数値の丸め方は、四捨五入とした。 14．準拠したGLP 本試験は、「新規化学物質に係る試験及ぴ指定化学物質に係る有害性の調査の項目等を定める省令第4 条に規定する試験濾設について」（平成12年3月1日：環保安第41号、生衛発第268号、平成12・02q4基局第1号改正）（平成13年1月24日1医薬発43号、平成13・01・23製局第1号、環保企第13号一部改め）（化学物質GLP）に基づき標準操作手順書に従って実施した。 15．試資料の保管当該試験に関する記録及ぴ試資料は広栄テクノサービス株式会社のGLP施設が保有する試資料保管室に保管する。 16，試験成績の信頼性に影響を及ぼしたと思われる環境要因無 4 KOE［TECHNO SERV［CE 試験No．BO2009 試験結果 1．試験条件の確認付表1に示すように、酸素消費量より算出されるアニリンの分解度が暴露試験開始7日後で52％であったので、本試験は有効である。 2．残存率及ぴ分解度表1に示すように、暴露試験開始28日後の酸素消費量による分解度は、平均一7％であった。直接定量による残存率は、被験物質分解区1平均100％、被験物質一水区1100％であり、分解度は、平均一1％であった。表1 3 被験物質分解区一7 被験物質分解区被験物質分解区一7 5 No．直接定量ﾉよる結果試験区 3 被験物質分解区 4 被験物質分解区被験物質分解区 5 6 付表平均値 4 付図t 酸素消費量ﾉよる結果分解度〔％）試験区 No．一7 付表1 付図1 付表付図付表2 Q−1∼ Q−6 一7 残存率（％）平均値 100 100 100 101 平均値一1 付図一1 一1 一1 100 被験物質一水区分解度〔％）一注）No．：クーロメ一夕検出部のNo．を示す。 3．残留丁OC量表2に示すように、理論TOC量17．Omgに対し、TOC残存率は被験物質分解区；平均120％、被験物質一水区；102％であり、分解度は、平均一17％であった。表2 晦試験区 3 被験物質分解区被験物質分解区被験物質分解区被験物質一水区 4 5 6 TOC量判平均値（mg） 19．0 24．7 17．5 20．4 17．4 残存率（％） U2 平均値 145 103 120 102 分解度（％）付表付図付表3 付図3 平均値一9 一17 一42 一1 一注）恥：クーロメータ検出部の嵐を示す。幸1 甯ｱ物質分解区は基礎呼吸区を、被験物質一水区は試験使用超純水プランクを差し引いた値。 5 KOEI TECHNO SE：RV［CE 試験No．BO2009 4，暴露試験中及び暴露試験終了後に実施した観察及び測定暴露試験期間（2002年10月3日∼2002年10月31日）を通じて実施した1日1回の観察（但し、休日合計 9日を除く）は、表3に示した。表3 クーロメ一夕恒温槽温度期間を通じ25．0∼25．1℃であった。被験物質分解区：0∼28日後 1溶解甯ｱ物質一水区：0∼28日後 1溶解被験物質の溶解状態アニリン分解区 10∼1日後 1やや白濁：2∼3日後；観察せず（休日）試験液の色汚泥の増殖状態：4∼28日後；白濁∼やや淡黄白濁被験物質分解区：0∼28日後：やや白濁被験物質一水区：0∼28日後；無色アニリン分解区：0∼5日後；増殖なし：6日後：増殖が認められた被験物質分解区：0∼28日後；増殖なし、表4に試験終了液の観察及び測定結果を示した。表4 被験物質一水区 6 4 5 溶解やや白濁溶解やや白濁溶解やや白濁無無無｝ 7．17 7．15 7．17 5．03 クーロメータ検出部No．試験終了液の被験物質溶解状態試験終了液の試験液の色試験終了液の汚泥増殖状態被験物質分解区 3 試験終了液のpH 溶解無色 5、被験物質の物質確認及ぴ保管条件下に於ける安定性確認物質確認；試験施設測定MS、NMR（試験計画書に添付）及びIR（付図4）スペクトルによる同定より物質確認を行い、被験物質に相違ないことを確認した。安定性確認1暴露試験開始日（付図5）及び暴露試験終了日（付図6）にIR分析を行い、付図4とも比較して試験期間を通じて安定であることを確認した。考察 K−1671の本試験条件下における28日後の酸素消費量による分解度は、平均一7％であった。被験物質分解区の酸素消費量が28日間を通して0、Omgであったことより、被験物質による呼吸阻害の可能性が示唆された。直接定量によるK−1671の残存率は、被験物質分解区；平均100％、被験物質一水区l lOO％であり、分解度は、平均一1％であった。全有機炭素残存率は、被験物質分解区；平均120％、被験物質一水区；102％であり、分解度は、平均一17％であった。被験物質分解区で残存率が多いのは、酸素消費量より呼吸阻害性が疑われることから，死滅した微生物から有機物が溶出したと考えられる。以しの結果より，K−t6ア1は，本条件下において微生物等により分解され難いと考えられる， 6 KOElTF：CHNOSERVIC巳試験No．BO2009 結論 K−1671は、本試験条件において微生物等により分解され婬いと判断された。付表付表1 付表2 付表3 酸素消費量分析測定表 LCによるK−1671残留量分析測定表 TOC分析測定表付図付図1 付図2−1 付図2−2 付図2−3 付図2−4 付図2−5 付図2−6 付図3 付図4 付図5 付図6 付図7 酸素消費量曲線・直接定量K−1671LC分析検量線及び分析測定結果 LC分析標準液クロマトグラム LC分析標準液クロマトグラム LC分析残留量測定クロマトグラム LC分析残留量測定クロマトグラム LC分析残雪量測定クロマトグラム TOC分析測定結果・ lRスペクトル同定及び物質確認（試験施設（2002・8．6）取得データ） IRスペクトル安定性確認（暴露試験開始日（2002．10．3）取得データ）［Rスペクトル安定性確認（暴露試験終了日（2002．10、31）取得データ）被験物質の物質確認・保管条件下に於ける安定性確認表戸’ KOE【TECHNO SERVICE BO2009 （装置番号： A−4 試験条件：被験物質濃度：活性汚泥濃度：培養温度：培養期間：︶ B ODチャート試験番号：／図一1 試料名 BOD（㎎） 7日 14日 21日 28日 47．7 69．8 圃基礎呼吸囹汚泥＋被験物質 73．3 73，．4 o．o 2．5 4．3 4．3 0．0 25 士 1’C 0．O 囚汚泥＋被験物質 0．0 0．0 0．0 28日〔10／3∼10／31，2002） 0．O 囹汚泥＋被験物質 0．0 0．O 0．0 O．0 囹水＋被験物質 0．0 0．O 0．O O．0 0．0 0．O 田汚泥＋アニリン o訓。うl lOO（㎎／9） 30（㎎／9）備考： 100 ﹂ 80 諺 0 6 ‡図一︵営︶oOoo 40 20 一一一＝＝：」一一『一一一一一｝一一』一『一『『一『一一一一一圃 7 画因圖囹 21 14 28 培養期間（日）平成厚年’O月う1日鼎湘藻湘陣母船 0