資料２-２ 2015年５月15日 iPS細胞由来神経幹細胞の腫瘍原性に関する検討慶應義塾大学医学部岡野栄之 iPS細胞を用いた脊髄再生医療の実現に向けて • iPS細胞の樹立に3ヶ月、さらに神経分化に3ヶ月、約半年の時間を要するボランティア体細胞 OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, DNp53 • 十分な安全性の検証と品質管理が困難 • 費用がかかる脊髄損傷患者 iPS細胞 iPS細胞バンク(CiRA) • 臨床に使用するより安全なiPS細胞ストックの樹立 iPS細胞由来神経幹細胞 • 移植細胞による腫瘍形成 ① 安全性評価法の確立 iPS-NSC • 安全性スクリーニング法の確立 • 分化誘導法の最適化 ② 脊髄再生医療に用いる細胞の製造 2 2 Okano and Yamanaka, Molecular Brain, 2014 ヒトiPS細胞由来神経幹細胞のマウス脊髄損傷モデルへの移植長期経過観察後の下肢運動機能評価と腫瘍形成 BMS (112 day-follow-up) 201B7株由来神経幹細胞移植群では腫瘍形成を認めなかったが、253G1株由来神経幹細胞移植群では腫瘍形成を認めた Normal neural differentiation NeuN Venus Merge Nori et al.: PNAS, 2011, Stem Cell Reports, 2015 3 安全性評価法の確立（造腫瘍性を含む） ③ 分化誘導法の至適化 -LIF 造腫瘍性無し良い神経幹細胞良いiPS細胞胚様体悪いiPS細胞 ① iPS細胞の評価法の確立造腫瘍性有り悪い神経幹細胞 ② iPS-NSCの評価法の確立 4 神経分化誘導法の至適化 0 7 iPSCs 21 (P1) 14 誘導工程 protocol A EB formation day in vitro 拡大培養 EB Floating neurosphere protocol B EB Rosette sphere neurosphere protocol C EB Rosette sphere monolayer • • In vitroの評価 In vivo の評価造腫瘍性の検討【解析に使用したCiRA-iPS細胞株】 Feeder free-iPSCs 由来 1027B6 PBMN (T) 1129B6 PBMN (T) 1210B2 PBMN (nT) 1231A2 PBMN (nT) 1231A3 （検証会株: nT） On feeder-iPSCs 由来 585A1 PBMN (T) 1108C2 PBMN (T) 1108D2 PBMN (T) 1210A2 PBMN (nT) 1201C1 （検証会株: nT） 5 iPS-NSCの評価法の確立 mRNA NGS RT-PCR mRNA mRNA mRNA mRNA DNA methylation M CpG M CpG M CpG Target gene Oncogene’s SNPs Fusion gene CNVの変化 DNA SN P Fusion gene 6 造腫瘍性(＋) iPS-NSCで高発現遺伝子の特定移植前 iPS-NSC（レトロで樹立）造腫瘍性＋細胞株で発現が高かった遺伝子移植前 Integration-free iPS-NSC造腫瘍性＋細胞株で発現が高かった遺伝子移植後 iPS-NSC（レトロで樹立）造腫瘍性＋細胞株で発現が高かった遺伝子移植後 Integration-free iPS-NSC造腫瘍性＋細胞株で発現が高かった遺伝子（発現が5倍以上） 7 ③ iPS細胞由来神経幹細胞の評価法の確立造腫瘍性(＋) iPS細胞由来神経幹細胞で発現が高かった遺伝子の特定 Nori et al.: Stem Cell Reports, 2015 8 CNV解析 fibroblast 253G1 201B7 836B3 414C2 Copy number 茶：0 橙：1 緑:2 青:3 紫 : 4以上 • 80万以上のSNPプローブによって、copy numberの変化を解析 9 安全性評価法の確立（造腫瘍性を含む）分化誘導法の至適化プロトコールA -LIF 造腫瘍性無し良いiPS細胞良い神経幹細胞胚様体悪いiPS細胞 iPS細胞の評価法の確立 *Re-programmingに関わる17遺伝子発現 *CNV 造腫瘍性有り悪い神経幹細胞 iPS-NSCの評価法の確立 *造腫瘍性に関わる55遺伝子発現 *DNAメチル化異常 10 ② 脊髄再生医療に用いる細胞の製造治療用細胞準備工程神経前駆細胞（治療用）解凍、移植用培地に細胞懸濁液体窒素で凍結保管臨床研究凍結保管工程細胞凍結神経前駆細胞（最終製品）継続培養を繰り返す細胞ストック iPS を含む分無子阻血化害清合剤培物地 + へ神経前駆細胞増幅工程初代神経前駆細胞 R O C K 胚様体（中間細胞株）再生医療用中核拠点CiRA 神経分化誘導工程低輸送試験安全性試験造腫瘍性試験効能試験凍結･融解安定性試験新規プログラムフリーザー 11