Data Sheet Pfu-X Polymerase Proofreading DNA polymerase for high accuracy Pyrococcus furiosus, recombinant, E. coli Pfu-X Polymerase 【本酵素の特徴】本酵素は 3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有し、高い校正機能を持つポリメラーゼであり、High Fidelity が要求される DNA 増幅を行う場合に有効です。高い正確性を示し(Taq の約 50 倍、従来の Pfu polymerase の約 2 倍、ER 2)Pfu-x polymerase= =0.25×10-6 )、また合成速度も従来品に比べて速くなっており、長いターゲットを迅速に増幅することができます(1kb/30sec)。 1) 本酵素の PCR 産物は平滑化されており、平滑末端クローニング法によってクローニングできます。 2) ER(エラー率)は、変異頻度／塩基数×サイクル数によって算出されます。【内容】 ● 2.5units/μl Pfu-X DNA polymerase (red cap) ● 10×Pfu-X buffer (green cap) 100 μl 1100 μl 【PCR プロトコール】 ● 反応溶液の調製 50 μl PCR Assay 5μl Pfu-X buffer green cap 200μM each dNTP 2μl 10μM forward Primer 2μl 10μM reverse Primer 1-100 ng Template DNA 0.5μl 2.5units/μl Pfu-X polymerase 1) Fill up to 50μM PCR grade H2O ※dNTP は 10mM を 1μl 使用で 200μM red cap ● PCR 反応 ① 3kb 以下の DNA 増幅を行う場合 Initial denaturation 95℃ 2 min Denaturation 95℃ 20 sec 50-68℃ 20 sec 68℃ 30 sec/kb 68℃ 30 sec/kb Annealing2) Elongation 3) Final Elongation 1× 25-30× 1× Pfu-X Polymerase Data Sheet Pfu-X Polymerase ② 3kb 以上の DNA 増幅を行う場合以下に示す反応手順は、2 ステップのサイクリングプロトコールであり、Primer の Tm 値が高い場合に有効です。 Tm 値 65 以下の場合、もしくは 2 ステップのサイクリングプロトコールで反応産物の品質に問題がある場合には、 3 ステップのサイクリングプロトコールをお勧めいたします。 Initial denaturation 95℃ 2 min Denaturation 95℃ 20 sec 68℃ 30 sec/kb 68℃ 30 sec/kb Annealing／ Elongation 2,3) Final Elongation 1× 25-30× 1× 1) ポリメラーゼは反応試薬中、必ず最後に添加して下さい。 2) アニーリング温度は使用する Primer の Tm 値に依存します。 3) 伸長時間は、増幅したいターゲット DNA の長さに依存します(30sec/1kb)。【活性の定義】 74℃で 30 分間に 10nmol のデオキシヌクレオチドを不溶性沈殿に取り込む酵素量を 1unit とする。【保存】 -20℃ ※本試薬は研究目的の場合にのみご使用いただけます。診断・臨床用試薬として使用しないで下さい。本製品の使用にあたり、安全性の確保に十分留意して下さい。 Pfu-X Polymerase Data Sheet 販売元株式会社グライナージャパン東京都港区赤坂 2-17-44 福吉坂ビル 2 階 TEL：03-3505-8875 FAX：03-3505-8945 http://www.greiner-bio-one.co.jp/ テクニカルサポート株式会社ファスマックバイオ研究支援事業部神奈川県厚木市岡田 3088 ケーオービル A 棟 4 階 TEL：046-222-6962 FAX：046-222-8444 Mail：[email protected]