分子病理診断の基礎技術と原理 ー分子病理診断講習会ー 大阪大学大学院医学系研究科 病態病理学・病理診断科 森井 英一 第１０４回日本病理学会総会 COI 開示 筆頭発表者名：森井 英一 演題発表に関連し、開示すべきCIO関係 にある企業などはありません。 基本中の基本 染色体 （山のような遺伝子の集まり） DNA RNA 蛋白質 基本中の基本 染色体 （山のような遺伝子の集まり） PCR DNA RNA 蛋白質 基本中の基本 染色体 （山のような遺伝子の集まり） PCR DNA Western Blotting RNA 蛋白質 PCR 欲しい遺伝子の欲しい場所のみ増幅して手に入れる 遺伝子 A 遺伝子 B 遺伝子 C 遺伝子 Z PCR 欲しい遺伝子の欲しい場所のみ増幅して手に入れる 遺伝子 A 遺伝子 B 遺伝子 C 遺伝子 Z PCR 欲しい遺伝子の欲しい場所のみ増幅して手に入れる 遺伝子 A 遺伝子 B 遺伝子 C 遺伝子 Z HybridizationとDNA polymeraseの活用 Hybridization ある一本鎖DNAと相補的な配列をもつ一本鎖DNAの結合 DNA Hybridization ある一本鎖DNAと相補的な配列をもつ一本鎖DNAの結合 DNA 5’-GTAGAAGGCCT-3’ 3’-CATCTTCCGGA-5’ DNA polymerase 一本鎖DNAの一部が二本鎖になると、そこからDNAを 伸ばして全体を二本鎖にする酵素 DNA DNA polymerase 一本鎖DNAの一部が二本鎖になると、そこからDNAを 伸ばして全体を二本鎖にする酵素 DNA primer PCR 準備するもの 増幅したい部分の両端を認識する短いDNA （primer) Taq polymerase サーマルサイクラー（温度を時間を決めて上げ下げする装置） 遺伝子 A HybridizationとDNA polymeraseの活用 PCR 準備するもの 増幅したい部分の両端を認識する短いDNA （primer) Taq polymerase サーマルサイクラー（温度を時間を決めて上げ下げする装置） 遺伝子 A HybridizationとDNA polymeraseの活用 PCR 室温 94度 50度 （一例） PCR 50度 72度 94度 PCR 94度 50度 PCR 50度 72度 PCR 94度、50度、72度を繰り返すことで、DNAの一部が増幅できる PCR 増幅したいDNAの量が、もともと多ければ、、、、、 早くDNAが増幅される。 これを利用すれば、RNAの量を定量することができる。 (RT-PCR) RT-PCR mRNA 逆転写 (Reverse Transcription, RT) cDNA cDNAの量をPCRで見積もることで、 元のmRNAの量を定量する。 RT-PCR mRNA 逆転写 (Reverse Transcription, RT) cDNA PCR RT-PCR mRNA 逆転写 (Reverse Transcription, RT) cDNA PCR 均等に増幅されることが大前提 PCRにおけるサイクル数とDNA量 DNA量 サイクル数 PCRにおけるサイクル数とDNA量 DNA量 サイクル数 PCRにおけるサイクル数とDNA量 DNA量 サイクル数 １サイクル毎に増幅されたDNA量を定量 DNA量 サイクル数 定量的PCR 基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく 定量的PCR 基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく 定量的PCR 基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく 蛍光量をサイクル毎に 測定する 定量的PCR 基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく 蛍光量をサイクル毎に 測定する 欠点は、非特異的に増幅されたDNAも一緒に測定されてしまうこと 定量的PCR TaqMan法 相補的なプローブ 発光物質 プライマー 消光物質 定量的PCR TaqMan法 プライマー 定量的PCR TaqMan法 プライマー 定量的PCR TaqMan法 プライマー 定量的PCR Western Blotting あるタンパク質の量を見積もる方法 タンパク質 A タンパク質 B タンパク質 C ・ ・ ・ タンパク質 Z 膜の上での物探し タンパク質を電気泳動 膜の上に移す 膜の上での物探し タンパク質を電気泳動 膜の上に移す 目的のものは、どこにあるのか？ 抗原ー抗体反応を利用 目的の蛋白質 Western blotting法 目的の蛋白質に特異的な抗体 Western Blottingの例 ふたたび 染色体 （山のような遺伝子の集まり） PCR DNA Western Blotting RNA 蛋白質
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