Title 日本型イネに導入した紫米における着色色素の同定 Author(s) 佐藤, 博二; 中野, 英樹; 前川, 雅彦; 金内, 里恵; 市原, 耿民 Citation 北海道大学農学部農場研究報告 = Research bulletin of the University Farm Hokkaido University, 30: 47-53 Issue Date 1997-03-25 DOI Doc URL http://hdl.handle.net/2115/13434 Right Type bulletin Additional Information File Information 30_p47-53.pdf Instructions for use Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP 北海道大学農学部農場研究報告第 3 0号 47-53( 1 9 9 7 ) 日本型イネに導入した紫米における着色色素の同定佐藤博二・中野英樹 (北海道大学農学部附属農場) 前川雅彦 (岡山大学資源生物科学研究所) 金内里恵・市原取民 (北海道大学農学部生物機能化学科) ( 19 9 7年緒 1月 2 2日受理) は，アントシアニンによる紫色のみであるが，玄ー百米においては色調・模様に多様な変異が認められ植物が合成するアントシアニンは，葉の表皮細る。イネの粒色に関する遺伝子系については木下胞に蓄積し有害な紫外線の防御機構として働くばが詳しく述べているがへ大別して 2種の遺伝子 I L 抗酸化作用やファイトアレキシン系に分かれ，アントシアニン生成に関与する 3遺として作用することも知られている。さらに，利伝子の補足作用によって紫米となる系と 7)，種皮用面においても安全で、鮮やかな食品着色料とし着色の 2遺伝子の補足作用により赤米となる系でて，あるいは生体調節機能をもっ色素としての価ある 8)。これら粒色に関しては，既に，紫米に関し値があり，最近では，コレステロールの低下作用 1 赤米にては Nagaiらによりアントシアニンが9 かりでなくもあることが明らかとなった 2)。一方，アントシア関しては Nagaoらによりカテキン，カテコールニンは可視的形質として古くから二次代謝経路のタンニンが関与することが報告されている 10)。一研究対象となり，天然物化学・生物化学の進展も般に有色米は赤米もしくは黒米と称されるが，着あってその生合成経路が解明された。さらに最近色色素の化学的成分を考慮すると用語はかならずでは，分子生物学的手法の展開で，色素着色の組しも統ーされている分けではなく，前述のごとし織特異性や発現時期といった転写制御系の解明が玄米における着色・形態は多岐にわたり，色調と盛んになり，構成色素が一致しない場合もある。本論文では，トウモロコシでは色素着色の転写制御ネットワークが構築されようとしている。イネ粒色の呈色の主成分としてアントシアニンが考えでもトウモロコシと同様にアントシアニン着色はられる場合に紫米と記載した。トウ紫米のアントシアニンについてはインド型イネモロコシとは異り生合成経路も未だ明らかとなっ紫米について，特に色素利用を背景に，酒類醸造ておらず，また分子的転写制御系も不明で、ある o の原料として，インド型の紫米 11)，および臭い紫米最近，インド型の紫米から関与するアントシアニのアントシアニン色素の同定がおこなわれ 12)，ンが特定された 4)。また 1 9 9 3年にイネとトウモロ c y a n i d i nふ g I u c o s i d eを主成分とする 3種以上のコシのシンテニーが明らかになったことからめ，アントシアニンが紫米構成色素として存在するこイネのアントシアニン合成に係わる転写制御遺伝とが報告されている。古くから遺伝分析の対象となってきたがヘ子R α がとられベイネでも転写制御遺伝子系のネットワークが解明されようとしている。日本型イネの在来種には葉身のみ紫色する紫イネは存在するが，玄米がアントシアニンにより紫イネにおける着色形態は茎・穎から玄米にいた色もしくは黒色に着色するインド型イネに見られるまで種々多岐にわたっている。茎・葉においてる紫米は存在しない。しかしイネにおける着色形北海道大学農学部農場研究報告 4 8 第3 0号 ORz OH HO OH ， Rz R Cyanidin3-glucoside Pigmentl : Glucose H Cyanidin3 r u t i n o s i d e Pigment2: Rutinose H e o n i d i n3 r u t i n o s i d e Pigment3: Rutinose CH3 P F i g .1 . S t r u c t u r e so fP i g m e n t1 ， 2 ， a n d3f r o mp u r p l ep i g m e n t e d n c e . 態は遺伝子形質として古くから注目され，遺伝子方法と結果分析の結果各種の色調あるいは模様に関する遺伝子が確立され，インド型イネの紫米系と日本型イ 1.供試紫米ネとの交雑後代で、紫米に固定された日本型イネが茎葉部の色素抽出には，北海道品種しおかりに研究室規模で存在する。インド型イネの紫米と B 日本稲 A-77(紫イネ)の Pl遺伝子を導入した準本稲との交雑後代で紫米に固定された日本型イネ同質遺伝子型系統しおかり PIBCF2を，着色粒のの紫米のアントシアニンについての研究報告は， i r 色素抽出には，フィリッピン原産の紫米系統 P 著者の一人である前川らの報告があるのみであ u r u t o n gに A -5(赤室)および北海道在来種 A - る同。紫米は，栽培上，耐病性，耐雑草性にすぐれ 1 3(茶穂)を交雑して紫米を導入した系統 H406を用いた 13)。ており，この特性は紫米のアントシアニン色素生成との関連が推定される。また，農産加工原料として日本型イネの紫米はインド型イネの紫米で問題となる物理的特性や臭いなどの問題もなく，形 2 . 色素の抽出 i)しおかり PIBCF2茎葉部からの色素の抽 g ) をエタノール: 出・分離，紫色の茎葉部(l.5k 質導入は多くの利点が考えられる。本報告は，インド型イネの紫米系質を日本型イ 0 :0 . 5 : 5(V/ V )に浸漬し，室温に酢酸・水. 1 ネに導入した系統と，茎葉部のみ紫色を示す Pl 一夜放置して色素を抽出した(2回)。ロ別した色遺伝子を導入した，準同質遺伝子型系統を用い，素抽出液を濃縮後，少量の種子や葉からアントシアニンを分離し，日本型イ液に溶解し，不溶物を遠心分離で除いた後，上清ネに導入された紫米におけるアントシアニン色素部をシリカゲル ODS-Q3(富工ゲ、ル)のカラムにを同定し，紫米の加工食品への利用および分子生サンプリングした。カラムは物学的基礎知見を得ることを目的とした。 3 0%メタノール，メタノールで順次溶出した。 4%酢酸メタノール溶 4%酢酸を含む水， 4 9 佐藤・中野・前川・金内・市原:日本型イネに導入した紫米における着色色素の同定 . Rfv a l u e s and s p e c t r a lp r o p e r t i e so fa n t h o c y a n i nfrom l e a v e s andg r a i n so fp u r p l e T a b l e1 p i g m e n t e dr i c e R fv a l u e s * A n t h o cyanm BAW AH C y 3 g 1 u 1 2 3 4 5 0 . 3 9 0 . 3 9 041 046 o3 9 041 0 . 5 8 0 . 5 9 0 . 7 3 0 . 8 3 0 . 5 8 0 . 7 3 l%HCl BHA 004 o0 4 011 o1 8 005 0 . 1 0 0 . 2 3 0 . 2 3 0 . 2 8 0 . 3 4 0 . 2 4 0 . 2 8 s p e c t r a ld a t ai n0 . 0 1 %HCI-MeOH FAB-MS [ M + J A 1 C l3 λmax(nm) E"o/E . na x( % ) 5 7 0 2 7 9， 2 8 0， 5 3 0 2 7 9， 5 3 0 + 3 5 2 9 3 5 十 4 4 9 4 4 9 5 9 5 6 0 9 4 4 9 5 9 5 v ) 4: 1: 2( vI O *BAW n-BuOH:AcOH:H， AH AcOH: H C l: H， O 5 :1・5 O l%HClH C l :H， 2 :71 BHA n-BuOH: 4 C l: AcOH: H， O7 :2: 1・5 NH 鮮明な赤色を示した 30%メタノール (4%酢酸ン部 ( n ブタノール層)と糖部(水層部)に分け含有)溶出区分を濃縮して粗色素を得た。粗色素 0 た。糖部は炭酸銀で中和後 PPCおよび TLC ( 区分を TLC (フナセル SF20X20cm，AcOH: BuOH:P y r i d i o e:H20 HCl:H20 5 品と共に展開し，グルコースを同定した。またア 1 5v / v ) で展開した結果 Rf 6 4 3v / v ) で標値0 .59，0 . 7 3，0 . 8 3に少くとも 3つのスポットがグリコン部は標品とともに TLC (AcOH:HCl: 確認された，それぞれ Rf値の低い方から順に H20 Pigment1， 2および 3と仮称した。定した。 lH-NMR (CF3C02D-DMSO-d 6 粗色素区分は調製用 TLC(フナセル SF20x20 cm，AcOH:HCl:H20 5 1 5)，で精製 5 1 5v / v )で展開して c y a n i d i oを同 1 9) (図-2)では，アグリコン部のシアニジン由 S， H-4)，8 . 2 6( d d，J=2，9Hz，H 来の o8.95( 1 3 . 8mg乾因物)，を繰り返えして， Pigment1 ( 6 ' )， 8 . 0 3( d，J=2Hz，H 2 ' )， 7 . 0 3( d，J=9Hz， Pigment2 ( 2， 7mg)，Pigment3 (1mg) を得 H 5 ' )， 6 . 9 0( d，J=2Hz，H-8)， 6 . 6 8( d，J=2Hz，た。 H-4) の 6個のプロトンおよび糖部グルコース由 i i ) H4 0 6着色粒から色素の抽出・精製 4 4( d，J=6.8) 来のアノメリックプロトンが o5， H4 0 6 (玄米)を軽〈粉砕後， 1%塩酸・メタに，その他の 6個分のプロトンが o3 . 2 0 4 . 5 2にノールに浸漬して抽出を行った。抽出液を濃縮後， y a n i d i n3-0β 認められた事から Pigment1を c セファデックス LH-20カラムを通して，色素区 D-glucopyranosideと同定した。 UV-VIS スベ分を集めた。組色素区分は TLCの結果主成分の 0 . 0 1% HCI-MeOH)では λmax2 7 9，5 7 0 クトル ( 強いスポットとマイナ一成分の 2スポットのみが nmで AIC13 添加では深色移動を示しアントシア確認された。組色素区分を調製用 TLCで精製しニジン骨格の B環に隣接するフェノ -)レ性の水酸て， Pigment4と 5を単離した。基を有する事，また， E440/Emax値が 35%であることから Pigment1はモノグルコシドであり， 3 . 色素の同定 y a n i d i nの 3位であることを裏糖の結合位置が c i ) Pigment 1 FAB-MSスペクトルから y a n i d i n 3付けている。最終的には標品の c M+は m/z4 4 9に， m/z2 8 7(M+-glucose)のピ g l u c o s i d eと lH-NMR， FAR-MSのスベクトルークが認められた。 Pigmeot1を少量とり， 3N データーと TLCの Rf値(表塩酸メタノール溶液中で、 1 0 0 0 C，3 0分聞の加水分とにより決定した。解を行った。放冷後，メタノールを留去し，水で希釈した後， 0 ブタノール抽出を行ってアグリコ 1)を比較するこ i i ) Pigment2:FAB-MSスペクトルから M+ は m/z5 9 5および m/z4 4 9(MLrhamnose)のピ 5 0 北海道大学農学部農場研究報告第 3 0号 HO H / ~ J~I . . i v yy T I日 G 9.0 a.O T T ).0 PPM S.O 5.0 '.0 Z.O 7 1 .0 F i g . 2 . l H p u r p l ep μ i g m e n t 民e dr 討l C 白e . ークが認められた。 P igment2の塩酸による加水 3 0 1( p e o n i d i n )のピークを認めた。 Pigment3の y a n i d i nを，糖部分解ではアグリコン部としては c e o n i d i n 酸加水分解物から，アグリコンとして p としてグルコースとラムノースを同定した。 lH を，構成糖としてグルコースとラムノースを TLC ) では，アグリコン部 NMR スペクトル(図-3 igment1のシアニジンと同一ケのシグナルは P 上で確認した。 lH-NMR-スベクトルでは o 3 . 9 3 ミカルシフトカップリングで認められ，糖部グル igment2の NMRスペルが認められる以外は P . 3 4 (lH，d，コースのアノメリックプロトンが q5 クトルはほぼ同ーのケミカルシフトパターンを示 ]=7.0Hz) に，ラムノースのアノメリックプロト igment3をp e o n i d i n3-0-( 6 "0 -(α-Lした。 P ンが O4 . 4 9(lH，b r s )に認められる他グルコース， (3H，s )にペオニジン 3'位の -OCH3 基のジグナ rhamnopyransylβD-glucopyranoside))と同定ラムノースに由来の各プロトンが δ3.1-3.9に 7 9，5 3 0 した。 UV-US-スベクトルでは λmax2 igment2を c y a n i d i n 3 0 認められた事から P ( 6" 0 ( α 一L-rhamnopyranosy I ) 一 β-D-gluco nmで ALC13 添加では λmaxは移動を示さず，シアニジンの B環に存在した隣接するフェノール性 u t i n o s i d e )と同定した。 UV-VIS ス p y r a n o s i d e，r 水酸基が存在しない事を示している。 E440/Emax ペクトラムでは λmax2 8 0，5 3 0nm，A I C 13 添加で 35%であり， Pigment3の構造を裏付けた。 i v ) H4 0 6着色粒からの色素の同定 9%であり，深色移動を示し，E440/Emaxは 2 Pigment2の構造を裏付けた。 i i i ) Pigment 3 FAB-MSから M+は m/z 609，また m/z463 (MLrhamnose)， H-406着色粒から抽出・精製した Pigment4 および 5は表 -1に示すごとく TLC上の Rf値および FAB-MSの M+ピークを比較しそれぞ、佐藤・中野・前川・金内・市原:日本型イネに導入した紫米における着色色素の同定 5 1 H HO O H 3 5← 。グ HO 、ρ'i~" ‘QH -寸 r OH 1 1 l ii ハI h / I I ~ー i i i i ii i f川 ii I i ! F i g .3 . lH-NMR s p e c t r u mo fP i g m e n t2( c y a n i d i n3 0 ( ザ' 0 ( α L r h a m n o p y r a n o s y l )一βーDg l u c o p y r a n o s i d e )i s o l a t e dfroml e a v e so fp u r p l ep i g m e n t e dr I ce . P 1 W遺伝子を有し紫れ Pigment 1， 2と同ーであり， Pigment4を比は 70%以上と測定された。 c y a n i d i n3 g 1 u c o s i d ePigment5を c y a n i d i n3 - 葉・紫米である H-406の玄米部の色素抽出の結果 r u t i n o s i d eと同定した。も，粗色素区分は， TLC上で c y a n i d i n 3- y a n i d i n e 3g l u c o s i d eが大半であり，少量の c 考察 r h u t i n o s i d eを認めたにすぎない。インド型イネの C(花青素色原素)， A ( アクチベータ) 紫米のアントシアニンの構成比においてもと Pl却(紫葉)の 3遺伝子の補足作用によることが c y a n i d i n 3-g l u c o s i d eが大半であり，少量の遺伝子分析から明らカか冶にされている η c y a n i d i n e3 r u t i n o s i d eを認められてるにすぎな紫米はしおかり P 刊lBCF2はしおかりに日本稲 A 一い。インド型イネの紫米のアントシアニンの構成 7 η 7 (紫イネ)の P 円f遺伝子を導入し，葉身・葉鞘の比においても c y a n i d i n3 g 1 u c o s i d eが 6 0%以上み紫色となり玄米部は着色しない。しおがりを占めるとの報告もあり，これらの結果を考 IM2) PIBCF2の紫葉部から抽出したアントシアニン y a n i d i n 3慮、すると紫米の呈色主要成分は c はc yanidin 3-glucosideを主成分とする g l u c o s i d eである。又，アントシアニンのアグリコ c y a n i d i n 3-r u t i n o s i d eおよび p e o n i d i n 3 ン部はインド型イネ，日本型イネの紫米とも r u t i n o s i d eの 3種類であった。正確な定量は行な c y a n i d i nと p e o n i d i nの 2種のみであり，他のア ← わなかったが， TLCに展開後の粗色素区の各スポントシアニジンの存在については今の所報告例がットをかき取り，単純に比色した結果ではない。インド型イネの紫米から比較的多種類のア c y a n i d i n3 g 1 u c o s i d eのアントシアニン中の存在ントシアニンが同定されているに比べ，Plw遺伝 5 2 北海道大学農学部農場研究報告子導入で発現される日本型イネの紫米のアントシアニンは cyanidin3-g1ucosideを圧倒的多量な主成分とし，他のアントシアニンは質的にも量的にも微量であり，アントシアニンの構成は非常に単純化されている 1ぺ P l卸遺伝子導入による紫米アントシアニンの発現制御は輿味ある問題である。天然色素の直接的利用という観点から，紫米アントシアニン(主構成分 cyanidin3-g1ucoside)の食品加工における有効利用は今後の課題である。既にインド型イネの紫米を原料として用いた，日本酒醸造やリキュールへの利用報告があるが，今後は日本型イネに P l山遺伝子を導入した紫米による加工食品への原料として研究が多くなる事が予想される。利点は日本型イネを直接利用できる点であり，問題点は紫米における着色層は種皮部であり，清酒等への利用の場合精白で大部分の色素は「ヌカ J部に移行してしまう事である。紫米色素を「ヌカ」から抽出利用する場合はその原料的利点は大半は失なわれる。育種的改良が望まれる。引用文献 1 . Takahasi，A .，Takeda，K .andO h n i s h i，T . L i g h t I n d u c e da n t h o c y a n i nr e d u c e st h ee x t e n to fdamage t oDNA i nUVi r r a d i a t e dC e n t a u n ac y a n u sc e l li n 2，541-547( 1 9 9 1 ) c u l t u r e .P l a n tC e l lp h y s i o l3 2 .I g a r a s h i，K . ， Abe，S . and Satoh，J . E f f e c t so f 雪 s i c ac a m p e s t r i sL . ) Atsmi-Kabu ( R e d Tumip，Bra Anthocyanin on serum C h o l e s t e r o l L e v e l si n . l C h e m . 5 4 ， 1 7 1 C h o l e s t e r o n f e dR a t s .A g r i c .B i o 1 7 5( 1 9 9 0 ) 3 . 木下俊郎・日本型・インド型間における連鎖群の異同. 7集・ 19-34 ( 1 9 7 6 ) 育種学最近の進歩，第 1 4 . Reddy，V .S .，Dash，S . and Reddy，A .R . A n t h o c y a n i npathwayi nr i c e(0η' z as a t i v aL . ) ・ i d e n t i f i c a t i o no famutantshowingdominanti n h i b i t i o no f a n t h o c y a n i n si nl e a fanda c c u m u l a t i o no fp r o a n t h 第3 0号 lGene t .9 1: 3 0 1o c y a n i n si np e r i c a r p .T h e o r .App. 3 1 2( 1 9 9 5 ) 5 . Ahn，S .andTanksley，S .D . Comparativel i n k a g e . mapso ft h er i c eandmaizeg e n o m e s .P r o c .Na tl A c a d .S c i .9 0:7 9 8 0ー 7 9 8 4( 19 9 3 ) 6 . Hu，J .，Anderson，B .andW e s s l e r，S .R . I s o l a t i o n e n e s e v i d e n c ef o r and C h a r a c t e r i z a t i o no fR g d i s t i n c te v o l u t i o n a r yp l a n ti nr i c eandm a i z e .G e n e t . 1 4 2:1021-1031( 1 9 9 6 ) 7 . Nagao，S .，Takahashi，M. and K i n o s h i t a，T G e n e t i c a ls t u d i e s on r i c ep l a n t XXV1 . Mode o f i n h e r i t a n c eandc a u s a lg e n e sf o ronet y p eo fa n t h o c y a n i nc o l o rc h a r a c t e ri nf o r e i g nr i c ev a r i e t i e s .J 2:20-50( 1 9 6 2 ) F a c .A g r .HokkaidoU n i v .5 8 . Nagao， S .andTakahashi， M. G e n e t i c a ls t u d i e son r i c ep l a n t XXVII. T r i a lc o n s t r u c t i o no ft w e l v e .F a c .Ag r .Hokl i n k a g eg r o u p si nJ a p a n e s er i c e .J 3:72-107( 1 9 6 3 ) k a i d oU n i v .5 9 . Nagai，， . 1S u z u s h i n o，G .andS u z u k i，Y . Anthoxa n t h i n s and a n t h o c y a n i n si nO r i z a c e a e .J a p .J . 0:247-260( 1 9 6 0 ) B r e e d .1 1 0 . Nagao，S .，Takahashi，M. and Miyamoto，T . G e n e t i c a ls u t u d i e sonr i c ep l a n t .XX1 .B i o c h e m i c a l .G e n e t3 2: s t u d i e sonr e dr i c ep i g m e n t a t i o n .J a p .J 1 2 4ー 1 2 8( 1 9 5 7 ) 1 1 . Takahashi，K . ， Sugimoto，T .，Miura，T .，Washizu， . I s o l a t i o nandI d e n t i f i c a t i o n Y .andYoshizawa，K .B r e w .S o c .J apan8 4: 807o fRedR i c eP i g m e n t s .J 8 1 2( 1 9 8 9 ) 1 2 .T erahara，N .，S a i g u s a，N .，Ohba，R .andUeda，S . C o m p o s i t i o no fAnthocyaninPigmentsi nAromatic RedR i c eandi t sWine. NipponShokuhinKogyo 1:519-522( 1 9 9 4 ) G a k k a i s h i4 l3.前川雅彦，喜多富美治イネにおける遺伝的着色粒の抽出色素の分光特性.北海道大学農学部農場研究報告第2 3号:11-21 ( 1 9 8 3 ) 1 4 . 佐藤博二，前川雅彦未発表データー 1 5 . Yo s h i n a g a，K .，Takahashi，K .andYo s h i z a w a，K . . L i q u e r Making Using Pigments o f Red R i c eJ Brew.S o c .Japan8 1:337-340( 1 9 8 6 ) R e s .B u ll .U n i v .FarmHokkaidoU n i v .3 0:4 7-53( 1 9 9 7 ) 5 3 A n t h o c y a n i n sfromP u r p l eP i g m e n t e dR i c e( Ja p o n i c at y p e ) HirojiSATO，HidekiNAKANO a c u l t yo fA g r i c u l t u r e，HokkaidoU n i v e r s i t y，S a p p o r o0 6 0] a p a n ) ( E x p e r i m e n tFarms，F MasahikoMAEKA WA O n s t i t u t ef o rB i o r e s o u r c e s，OkayamaU n i v e r s i t y，K u r a s h i k i7 1 0] a p a n ) RieKANAUCHI， AkitamiICHIHARA a c u l t yo fA g r i c u l t u r e，HokkaidoU n i v e r s i t y，S a p p o r o0 6 0] a p a n ) ( D e p a r t m e n to fB i o s c i e n c ea n dC h e m i s t r y，F ( R e c e i v e d] a n u a r y2 2，1 9 9 7 ) Summary Thec h e m i c a ls t r u c t u r eo fa n t h o c y a n i ni np u r p l epigmentedr i c eweres t u d i e d . Thec h e m i c a l s t r u c t u r eo ft h r e ea n t h o c y a n i n si np u r p u ll e a v e so fS h i o k a r iPIBCF2havebeeni d e n t i f i e da sc y a n i d i n3 g l u c o s i d e，c y a n i d i n3 r u t i n o s i d e，andp e o n i d i n3 r u t i n o s i d ebyNMRandFABMSs p e c t r o s c o p y . The majora n t h o c y a n i no fp u r p u lpigmentedbrownr i c e( H 4 0 6 )hasbeeni d e n t i f i e da sc y a n i d i n3 g 1 u c o s i d e .