663 著原アクアポリン 4 遺伝子欠損誘導型マウスの作成菅井智明新潟大学脳研究所細胞神経生物学分野 ( 主任 : 崎村建司教授) Generation of Aquaporin 4 Conditional Knockout Mice Chiaki SUGAI B t o f C ell ul aI N e u r o b l 0 1 o B y ' D 血 ep a ' R T al D en ･ ' es eTC h I L] S ti t u t e N J1 g , ( D IT e Ct O I : . P T OL K j l t a U n J v e I Sl b a SA ' e n ) , られてるい P 4 である的に AQ P4 c P システムにより re /1 o x 樹立した . を欠失さ , 上で有用なツキワーマは哨乳動物にお , 本研究 . 脳機能と水チ部位 , ウス･ャネルとの時期特異的にと全身で C re リ活性依存的に欠失する r e ールとなると考えられるド: アクアポリン 4 ー A Q P 4 - fl o x マ , ココ , A 関連を解析すること Q ンビネョナルタその機能の恒常ために必須な事項であると考えられしかし , 脳浮腫に関連する研究以外に脳 e p ri n t r e q u e s t s t o : D e p ar t m e n t o f C ell u l ar N e u r o b i o l o g y r ai n R e se a 1 - 75 7 A C h i a ki S u G AI c h l n s ti 山t e N ii g a t a U n i v s ab i m a cb ト d N ii g a t a 9 5 1 - 8 5 85 J a p o ri an , 本研究で樹立 . ーゲテングィのが現状で Q A e r s it y o x 系統をした A Q P4 1 f l 0 Ⅹ マ P 4 の役割を解析する法 C , r e /1 o x P システム , ある . ついての研究はほとんど細胞膜は脂質二重層なのでにほとんど水は透過しかが､ように水の透過性の大き低い膿もあ別刷請求先 : R で特異アストロサイト無い性を維持する細胞そのために . ウス A Q P 4 - fl マ機能における水の役割 , このを計画した神経系 , スを発現するマウスとを交配すること - 脳高次機能における , るがい . はじめに脳における水の代謝と移動はを欠失できる P4 ことを確認したンディシウス系統様々な部位で発現していてではアストロサイトの A Q P 4 に着目し, C 5 7 B L / 6 系統の遺伝子背景をもつためはスせ, そしてこのにより A Q P 4 が C ウ ( A Q P) アクアポリン . 主要な分子は A Q の B ) K IM U R A その機能の恒常性を維持するために必須な事項であると考え脳における水の代謝と移動は . , 旨要ている , I る . この〒 9 51 実際には赤血球膜の , い膜もあれば , 透過性の差違が水のみを選択的に通過 - 85 8 5 新潟市旭町通り 1 - 7 5 7 新潟大学脳研究所細胞神経生物学分野菅井智明新潟医学会雑誌 6 64 させるチャネルタンパク ( A Q P) なりの存在の有無まりつ , によ 1 ) 2) 分子的基盤が与えられたポリアクアンとが近年明らかにるこ神経系を含む多くの組織に , 第 119 巻おける水輸送の哨乳動物におい . A Q P は 1 1 のサブタイプが報告されているて AQ P . 平成 1 7 年 ( 2 0 0 5) 第 11 号の E れ R V サイトにサブク c o pA Q P 4#3 bp の E ロ Sp I e C 57 B L / 6 A おおよそ30 k D , 4 量体を形成するれて ( NI A b 時計 ) o x ギプンーそ , 穴 ( ポア) 通さなを形成するいロリンーアラ i n g l e 五1 e の s 水分子を選択的中心の構造であ発現が我告されてであり , 上衣細胞の 4 る卜 6) 一 . 網膜 , 方ュ , 腎機能 , へ大量のこの能と水チた c re は脳イト細胞 , 9 の 3 脳室や蛸牛 , で発現してい関与も考も多えられてい , ャネ /1 o x P 関連を解析するルとの遺伝子システム 9) にしたことベより1 kbp I - Xh pA 4N I o 脳機 , を計画し l p ri m e r マョナルタウスを作成すること材料と方法 C 5 7 B L/ 6 マウスング D N A ライブラリ c トとして P C R を行いプ , ライマ ' CCA G CTGT GA T CC AAAC GA - 3 ) G G A AA G C C A AT A C A CT A G T T - 3 71 0 b p AQ l - 1 , ' G C T - 3) ' A A - 3) た , AQ 3 を用 ( ーて , ( ー , ' ) ンプレ ( AQ2 AQ4 5 ' ( を用 ' 5 いて (5 ' - A G C GCC CATGA m G GTCC いて 73 0 b p 断片を増幅しの D N A れ I リ n (5 e n e らの P CR 産物を p B lu ip t Ⅱ K S e s c r o ) - ンー ( - ) I フこのフラグメントを . - pA カセ n e o pN ーつ p ンカと p 14 1 1 グをテ Hi g h a m プレマー Nh ー e - C G G G G TA C C C 産物を K p 11o e o シーの Kp x I n m e ra s e , I で消化し n このフラ . フラグメント ' ンして, ョいたを用 D N A P o ly p 4 11 - 1 , をプンけたプライつ pA45 - N e o -lo x レトとして Hi n d Ⅲ リーマ D T l p ri ーント ( e r ' 5 - CC CA AGC ' ) G G T CC - 3 を作成 IO ) p M CI D T ApA チクショ ' (5 - G C A G A G G C C T G A T G C A A A A G - 3) m ロ皿 e r ' m m をテを用 P C R 産物を H i n d Ⅲ で消化してイゲン . ー - ョ ' (5 e r - F id e li t y い, P C R をライグ D T 2 p ri マル a シをつけたプライー m ンし, ー . C AT G メ ip t を e s c r - M C /1 o x # 5 の S e o 次に . ッ Bl u , トの両端 - C G G G GTACC TrG G G G GATCCA CA ) を行 P D T - M C #3 . こ - Ⅹh ンー ' u U lt r pf C CC AAG ' 5 - A AG G CATG AG TGA C GG A ( 平滑化) 4 5 k b p のフラグメントを作成したンカをテロンョ ( ク ' としたニブロ KS T G C A G A A A A A G C C A T G G T rA A C - 3) またアクアポリン 4 遺伝子のクロシ - . . ' の 6 kbp ーとした x グメントと pA4 N . ーローの作成ー G C T A G C - 3 ) と P s t I p ri S t r at a g シをプ ri p t I フラグメント5 kb p とライ - 1o e o によるディブ B としたーングし, ニ P st I , スにしたベクター PC R コン e sc に1 o x P 配列を挿入した配列を持ノックアウトが誘導可能なゲティング法を用いて , ーイトの A Q P 4 に着目アストロサクタ F RT 配列で挟んだ pgk - 4 , 細胞で特異的に A Q P 4 を欠失させのため, そ . ィングベトとして Kp 本研究で , ー p 14 - 1 る 7) 8 ) しゲテ . の集合管側膜にのタを得た p 4 1 1 - 1) , ロ主要な分子は A Q P 4 ー腎臓 A Q P4 はく発現しておりラ -1 ブクー R I - c o 得られたク p B lu をプ , しかつ , 人 4 1 1 - 1) , の E ーイプリダイゼハングし, ニーの S al I サイトにサ (p 1 4 クーラグメントを作成したアストロサのミ通り 14 - 1 A プロウスゲノムライブラリマ解析によりスクリ ( Q P #2 より 7 30 b p 種類いるが, 脳と脊髄のに水の pA . B を用いたプラ , 3) に通すことができる , のて砂るために脳と脊髄では少なくとも A Q P l ンニっポアは水分子を 1 . ホモ , でよく保存さーは膜の両サイドからからみ合ような構造物を作りの単量体でのこのファミリ . いるアスパラ } a それぞ Q P #3 より 710 pA . フラグメントを作成し, ンパクでングし, ニー R I - Ⅲi n d Ⅲ フラグメントを作成し c o は腰を 6 回貫通する比較的簡単な構造をした膜タありロを得た p A Q P 4#2 , ブA としたー月 11 ーニしたの N . ot ンして, C AG C GCC いた P C R , を行 - い , のフラグ 3 8 kbp . このフラグメントと I - Hi n d Ⅲ ( 平滑化) を挿入したングサイトの Hi n d m ベにクター Ⅲ フラグメント 4 5 kb p をラ . p A4 - 3 ' DT とした . p A 45 ' - 菅井 : N e o - 1o の S al I - A x ' と p A43 - D T 成したシ - s ° I . Q P 4 - fl . tvA グベクタィンゲテ - Q P 4 一皿o x 1 ( 平滑化) I a の 3 相同組換え領域を延長するし p 4 1 1 - ⅤⅩ とした H i n d Ⅲ- N I ot イプリダイズしたハの S al I - A I s c イグシ p A 45 - N . を . Q P 4 - fl 2 を作成した o x ) と p マ ' ) を行ラ ) 遺伝子組換え胞株 R E N K A 細胞 ( 崎村らが樹立) したなお . E S 細胞培養の , らの報告に従 S al I によ fl ある o x R - - クシ m l) し個の E S 細胞に導入したン後 38 かプしたを起細胞マイクた後 , ロイクレシ 9 6 0 FL F , ンにョロニンーェクロクシマして遺伝子組換えンし, ョの IC R 系統を樹立ウスウス腫にマ宮に移植ウスを C 57 B L / 6 マれら胞肱期まで培養しウスの子マこ . マした . ウスと交配したのロー N , 図 2B ' ) より P 型 15 kb e o 3A , , p 4 A) , , s . ネッ p . イマ st I N e o ノム D N A , を持もしくはマつ E S 細川包クロプ ' ロフラグメンプロブとー . ブによりー , K O 型 12 7 k b p . I で消化した a c プ e o N , ロブによりー ' プロ . ブによりー型 1 0 8 k b p を検出した e o . 5 lo ' (5 , . を用 ' より (図レ - いて K O D , 2C D 2 /o アガ 0 . h a s トとしてンのゲウス尾より抽出したゲノンのーロ 3 B) また . , プライ , マ 1o ー , 野生型出した ( 図 4 B) . - x と ' ) C G G A G G - 3 m ' ) O Y O B O) による PC R をスゲルを用いた電気泳動に , N e o 型 3 20 b p を検出したプライマ GG T AG AAGA CTCA AG -3 を行いゲ (T - 野生型 2 60 b p , ロ A CC CAT GA GA AG TCT GC TG TA - 3 ' (5 たっプンクウス尾より抽出したゲノマー - T A TA C C C T GC C -3 x 行 ' もしくは , 細胞シン耐性を持つ E S をテム D N A pc R ー - T G ブと同様の 1 5 k b p を検出した ( 図 2 B ) 野生型 12 8 kb m . ト解析オマイシン耐性 , いた P C R を用ー ' ) と 1o 10 00 b p , x ' (5 A 41 o x F -3 ' - A G (5 ' - A を用いて K O 型 26 0 b p を検 c cc A T G A G A A G T CT G CT GT A - 3 サザンプロ ' (5 1 - ブの位置を図 2 A に示したームにおいては N ゲノノム D N A ッから D N A を抽出を同定したを 8 細胞期した IC R 得られたキメランー型ネオト解析により標的遺伝子組換えコロニー 3 - 2 e R I で消化したゲノムでは 3 c o g/ m ッロ e o トとして - C C A G T G A C A ' ' b . p c R 解析ェをピー , れら細胞 N ( レーよりトランスフ . 7 日後に耐性コ , を検出したブとしたーしたゲノムでは 5 プロ . E こンジ偽妊娠ローら 48 時間後に G 41 8 (1 75 し . こした ES の ES クトエレサザンプロ , ボでッ北山 l の tv A Q P 4 - 2 50 V , 条件選別を開始クア 2 を 0 Ⅹ 7 ョ m o . プ得い, 5 80 b p のフ , ' 野生型 13 2 k b p 5 プの 1 × 10 , ン (5 r o p ( Ⅹ ＋) p EJ 2 . 消化 I で a c ' は t v A Q P 4 1 fl い由来斉田いて作出てはついて直線化した 2 5 p っを用ロト 5 8 0 b p フラグメントを精製し . 1 1) たっ詳細にウスマプ ' をテと ' を行のフラグメントを精製して 3 い , 55 0 b p ブとしたー s ウスは C 5 7 B L/ 6 I で消化し e 3 - 1 - 1 e プラ , ' いた P C R ' b を用 e o トとしてー AA GT G CATA GT G CC G TTC - 3 x 細胞の培養マを用ノム D N A r o れこ . , 5 - G G T G A G A A A ( 5 - 2 e したそれぞれのプロ C 57 B L / 6 E S レを精製して 5 p ープン ' b r o N , し - A A G G C AT G A GT GA CT G A G C A T TC A G T A T - 3 と p A 43 - フラグメント 10 5 kbp I s ° プライ - - lo e o ' c 57 B L/ 6 のゲ ' . ンして, t v A ョ ' フラグメント 7 3 kbp D T 2 の S al I - A ーをライゲ (5 AQ l - 1 ーラグメントの P D T - M C #3 , . とした I t マ ' たっ ' 3 , 消化で 12 ) をテン p 14 - 1 ーられた P C R 産物を N h Ⅲi n d Ⅲ - のフラグメント 4 5 kbp ンして , p A 43 - D T 2 ョ o ロ I ' ンに転写し , 5 G GG TG CTG GA G - 3 ンしてョプレ R c o 電気泳動を行ルでいて G C T - 3 R V - c o I - N H a m と pA43 - D T ' シシー ' Ⅲ Ⅰ フラグメント 1 kbp a m ダ p 4 1 1 - ⅤⅩ の B . をE p 41 卜 1 . セルフライ , フラグメント 5 kbp B たっいは E ロンメンイ改変のー構築を行ために以下の Ⅹb ' あるゲス - 665 をナイクタ I a c ロ . 1 を作 o x を S o 6 % アガフラグメント 8 3 ウスの作成マム D N A . ンして , tv A ョ遺伝子欠損誘導型ン 4 フラグメント 7 3 kb p I - A の S al kbp をライゲ I s ° ポリアクア ' ) 新潟医学会雑誌 66 6 平成第 11 号 S I E V p 14 - 1 第 11 9 巻年 ( 2 0 0 5) 17 11 月 E I p411-1 E V G S I - J / I ) I - : ノ - S I E V ンー / ･ - ,_I :: ト ± - 1kbp : - ー I : ∼ - / E I ⊥ l - E I , ー _ J ￣ノノ / / - / J - - - J / / ' _ = I; - - 一 E V E I e n o m e - S I ノ - / / - / ル / ー - ー - - ▲ サーーー - g ー RN A m M l h42 p AQ P4# 2 M3 h44 h46 M:5 100bp < > AQ 卜1 ^ l n . p AQ P4 l ] AQ 3 n #3 < > AQ 4 A Q2 図1 上よりン - , ノムクロゲ , D N A ク c ロンした EI E 長方形で表示 . 結 , c o ン 4 遺伝子のアクアポリン 4 , ングにニーポリアクアー用いたプライ R I; E V E , c o マクングニー遺伝子の構造 m R N A の構造 c D N A ク ( 矢印) を示しているエクソンは黒 , I; M l - M 6 ac , 推定膜貫通領域 , このクロ . アクアポリン 4 遺伝子のクロタ - ゲティ本研究でリンングベクタは ( A Q P) を目的として遺伝子ウス c fl o x アスト , 4 遺伝子 , C re エクソン2 から4 のフラグメントをプロスゲノムライブラリ kb p のインサ p 1 2 - 1) , pA ーーをスクリを持下流を持の E 2 個 (図 1) つーつーニ陽性ク 2 ニ e I と (pA Q マの . こっクロれらは , いたが, た . そフラグメントーエエンウ ( p 41 卜 1) I 5 ' , 側の ' 挿入してタン直線化ク 6 ES 細胞の 5 クイゲテ , し 5 , ロシイたを得た換ョ . ' エプローゲテ - 流の上につ 3 る標的領ロ挿入 t vA ーエした . かの下流 Q P 4 - fl ヘ 1 o x ボシーロを C 57 B L/ ンしたョンーーをS a c ネオ . イプリダイゼブを用ハたが陽性クンは得られなかこで , p 411 - 1 , ク 2 2 kbp 下ロ流ローンーヘマ I で消化いてサザン . ク 3 8 . ン p 411 - 1 ー側 1 o x P 配列レ 82 0 クそ域を , ' , 換え領域を取みィングベクタレクトロを行え領相同組ィングベクタンっより作成 . 耐性を持シン ' 配列 1o x P したタヘ 1 k b p P st I - 欠失させ , 相同組み換え領域はク - ィングベ P C R を用いて p1 4 - 1 から , を含む 4 kbp ソン 1 しまた . ゲテ - ン p 14 - 1 ー 1oxP 配列の間に挿入しとしたタを含む 3 , フラグメントをクロつの得 . 膜貫通領域とポア構成領域を . クソン 2 エとした ( 図2 A) こでをプした非転クソン2 から 3 - エンを用いて, ーら P C R を用いて取得しングし, 18 1 陽性を作製ドした o 域ロ kbp の 3 R I - H in d c o . ー , P # 3) ングを行い, 15 6 kb p のロマ . ていなか R I - Sp c o トを持っ Q P4 ブとして C 5 7 B L/ 6 ーを得たブとしてスクリンサーいた A A Q P # 2) 73 0 b p Q P #2 の E Ⅹh P C R を用い - (p ら 5 一非転写領域を含んでの Q P#3 bp ' ソン 3 かソン 3 トー RT , 作成 c 5 7 B L/ 6 , コしたクーーウスマを用まず . よりー pA . III (p 1 4 - 1 システム部を含む一ングしたニクアウトッを含む 7 10 クソン 0 から3 ロのノライブラリエクタサイト特異的なアクアポロ /1 o x P てをク構築ウスを作成したマ D N A ーのー取得ングといた . ' ンはー写領域までを含んでニい . ( 図 l) ーロ , ー R V; SI S 果ロを用いて 3 延長したベ ' - っ相同組クター菅井 : アクアポリン 4 遺伝子欠損誘導型ウスの作成マ 667 A E V G S I E i E V S I E I e n o m e エロ t v AQ P 4 flo x l t vA QP4 flo x 2 T g et ed 1kb p 凸e o 1□ n e O S I a r l (A QP 4 o x て蒜芦T S れe o d x ' ト冒 T= o 玉F A41 n , . , 1 ｡ Ⅹ5 - 1 E I:. 7 , o x3 E I , n o m e 竿 ; g e t ed a r T S J S I T E I n c o ) ; S I I S I E I g e n o m e E I S I g e n o m e ( A Q P 4 ￣) C B 巌㌔㌔ 15k bp 13 2k bp 巨 . 320b 12 馳b p 10 8k b p . 260b . ) 5 N . ( A Q P ) 4 遺伝子遺伝子 ( A Q P 4 1 ; アクアポリンティング後の遺伝子 ( A Q 造を示で s p gk B . . I; A Q P 4 - 丑o eo タ - ; -) 1o , ゲテ x 黒 - n e o - 3 , ' 1o x5 . , マ後ーの遺伝子の pA ッーカセングベクタ下にを矢印で示したト ' , . 陽性クブで解析した結果を示したプライマ組換えによりネオエクソン 2 黒い長方形 . P 4 - fl ox マ , イシン o x 2) タ , , トに用いたプッ耐性遺伝子を除いロクソン ; E I, E エ , ゲ - 3 を欠失した遺伝子 ( A Q P 4 ￣ ) ジフテリア毒素 A , 1 t v A Q P 4 - fl ブを黒色ー c o R I; E V 断片遺伝子 , E カセたの構長方形の co R V ; SI , ット; , n e o . トによる遺伝子型解析ー作製 (t v A Q ーサザンプロ , ッウスのマ F R T 配列間の , プロ 1ox 3 ) x P 配列間の組み換えによりィング p c R による遺伝子型解析 ' n e o ゲティ - 三角形 1 o x P 配列; 半円 F R T 配列; D T いサザンプロ n c P4 . P C R に用いたプライ , a c した o x タ , o x l ) 3 e o 図2 A ㌔ぶ㌔㌔ . 陽性クロを用いた PCR ーのローン (A Q P 4 ＋/l o ) および野生型 ( W t) を用 x い , 5 ' ン . , (A Q P 4 ＋/l o 結果を示した x . ) および野生型 ( W t) の ES 細胞ゲノムの新潟医学会雑誌 66 8 第1 1 9 巻 A 払 15 k b P 13 2 k b p 図3 A A Q P 4 一皿o . S B . A Q P 4 - fl 結果を示した tv A Q P 4 - fl エレクトロ ( 図 2 o x ボレシー耐性を持つ 6 5 1 クよりスクリ ( 122 - 10 4 ー 12 5 , 2 - 1o ユ側のころ N , o の 260 b p 出されロ o x をサザンプロたっ結果ネオ . ッ個 5 , 1 28 - 7 1 のみが検出さった , 認した . プ e o ロへのンー 12 9 - , ローンに対し B , の 3 20 b p っっザンのササザたとが検た3 クロ ' A Q P4 fl o マ x ン解析 , P C R 解イプリダイゼス初期月杢によりい , キメキメマイクロラマウスラマウスした ES インジェ細胞ククシを作製したを選択しとにより Fl 個体を得た . , で PC R ( W t) マを行った . ョロンをマウンすることに ES のシ - 個体ウスよりタマ判定に ' は PC R 結果からィングした変異アレルが , この . を確認できたこと , キメ , 得られた . A Q P 4 1 fl マ 0 Ⅹ 系統維持における遺伝子型 . 解析を用いた型ある b p が検出される ( 図 3 B) A Q P 4 1o ; いプライ . マー 1o ' x 5 - は A Q P 4l o x; - 型で 3 2 0 . A Q P4 n u A Q P4 n u n o c ll k C re マ寄与が大きてサザンプロした . k o u k n o c ウス D N A プリダイゼコンビネョ , を行スにおいて野生型 13 2 k b p これら Fl が検出されたウスの尾の . (図 4A) . っのゲノム o x マを用い遺伝子型を解析 , I で消化し 5 ンを発現するス - と樹立した A Q P 4 - fl , c するウスを作成マト P C R を行いッシリ 1 3) K O) 得られた仔の尾 . をSa - ( t re ウス系統の樹立マ t o u 全身で C , - ll k C 57 B L/ 6 と交配するこマ型 15 間を増幅する P C R を行うと野生型で 26 0 x , 約半数 , n e o ゲテ - n e o bp ブでー 3 A) ウス系統を樹立した 1ox3 たところっウスを C 5 7 B L/ 6 と交配させマロ (図生殖系列伝達する Fl を行ンョプ ' 5 , . k b p が検出されたラ I で消化後 a c で野生型 1 3 2 k b p と A Q P 4 1 o x; ウスを交配したー S , ために . ウス系統の樹立相同組換えを確認マを抽出しノム TL C N - プライーを . ン解析をていることを確にそれぞれ示した C っンでは野生型いてしく起こー 1o x3 , F l および野生型 , ' とメラノム D N A を行った結果を示したンキメラ . キ , 尾より抽出したゲョ ' ゲの 12 9 - 13 6 はさらに 3 , ブを用ーこれらのクロ析の結果を図2 ロー変異型 , 1 29 - 13 相同組換えが正 , れシ - 1o x 5 ト解析にのクロ P C R 解析で陽性であ . 12 2 - 1 04 ブと N ー 1 28 - 7 1 のク , , ハ 129 - 13 , れらのクこ . いイシンマ P 配列を検出する P C R を行 12 5 - 2 なかン N 行いを用ム D N A . て 3 プイプリダイゼで野生型の 1 3 2 k b p と変異型の 1 5 k b p の 2 本のバンドを検出したーハ ES 細胞 , ン , . ウスのマ . を行ングしたニーブでーンョロプロを作製し 2 A) トによる遺伝子型解析キメラッウスの P C R による遺伝子型解析マ ox ' より抽出したゲノスのウ 5 , 氷ウス系統の樹立マ x 仔 ( F l ) および野生型 ( w t) I で消化し ac ロ結 h 320b P 26ob p A Q P 4 一皿o ウスのサザンプマ x C 5 7 BI ノ6 の 1 3 6) 月 11 4 ･ o 年 ( 2 0 0 5) 17 B ㌔吹 N 平成第 11 号 ' プロたところ , ブでー Fl のハイマウと A Q P 4 ￣型 1 2 7 k b p . p C R 解析においてもプラアクアポリン 4 菅井 : 遺伝子欠損誘導型 A o Y 図4 AQ P4- K O A 型 ( W t) マウスのイプリダイゼ B - A 41 o x 野生型 100 0b 4 B) . ロ欠損 1000b p > 26Ob p I 用いて A コンビネ - 尾より抽出したゲンョノム D N A を行った結果を示した行った結果を示した ' い , Q P 4 ￣型 2 6 0 b p が検出されたら標的遺伝子配列を , A Q P 4 - fl れらのこ , 系統を樹立ウスマヘテウスをマしたまた . ウスにおいて C マ o x re , リ依存的に標的遺伝子配列を欠損できスることが明らかとなったをS テヘ . I で消化し 5 ac , , テヘ . ( ＋/ - ) KO ロ A 41 o x F 1o x3 , 位･ C , 時期特異的 r e 察 /1 o x P シ冗 ( ポア) fl o x を作成するために C 列でエクソン2 統を樹立のルラギーした , 3 の r e プC と M 5 - 6 間ンー A Q P 4 - fl A Q P 4 は膜貫通領域 . プロリいて, を用ステム標的配列であを挟んだのルンーアラニンー M PA b 部ウスでは C マるが 4- 5 及び NPA b 機能を A Q P4 の本研究ーハで PC R をウスマ ) 2 -3 o x ) を膜部分にこの , を含むル o x アスト , ロる本研究でクター tv A え体を得るイシ , 且o ( ことが確認 r e されたーっ ) . 発現を発現する re マノッ . ゲテ - た一 . ィングベロンを解析したが , とができなか M 3 このこ . 部位特異的に A Q P 4 を , , 領域が組換わ x 1 において 820 ク o x ン耐性クロこウスは C マ o x 最初に作成したタ , Q P 4 - fl 間マはクソン 2 エきると考えられるサイト特異的に C 交配により A Q P4 - . プ E を含むためにノックアウトでこるいは膜貫通領域ーウスを交配することによりオの活性依存的に r e ､ J で作成した A Q P - fl 系スパその中 L に水の通り , クアウトできることを意味するウスる 1o x P 配 o x ( マプE にあるア (N ブでを形成すると考えられてを欠失させとは遺伝子を欠損するに AQ P4 マ両サイドからからみ合わせウスとのでは野生 , ー野生型 ( W t) , プライ ' り遺伝子欠損が起本研究プロ ' . マ . 考 ( ＋/ - ) K O ロ . 間を増幅する P C R を行の結果か Q P4 K O 結果からッ x ウス系統の樹立マウスの P C R による遺伝子型解析マウスが同定されこの ll K O トによる遺伝子型解析ウスの尾より抽出したゲノム D N A を用い p と A マシ - n u マ F - 1 o x3 以上した A Q P4 - K O . A Q P4 1 ウスのサザンプロマ Y ぶ x 壬 2:iEE; (図 669 ＋ 15 k b p マ作成 B ㌔ xqS イウスのマ方 , ンのーネ相同組換 3 ' 側相同組み換え領域を 3 8 kbp から 6 kbp に 2 2 kbp 延 . 長したベクター tv A r . Q P 4 - fl o x 2 では 651 クローン 6 70 新潟医学会雑誌より 5 個の相同組換えクロた相同組換えこのことは, . ンを得るの効率がー第 119 巻唆するまた . . 率が大きく変化組換えが起延長により 2 2 kbp の , したことはクタことを示こるにはある種のもしれないー ) a 閥値が存在するのか 4 ) e B 遺伝子組み換え動物と報告されて 8) いる A Q P4 ら説明されているが, とも示して一いる機能がより顕著にな . 伝子背景を持つこの . 11 s: hi g h - i st r y ウ 1 4) 171 - 180 5 にあたこのた . ウスマ o x 系統 C 57 B L/ 6 , てっめゲ - 解析はティングッた辻田突如さんてくださった阿部を担当してくださ , 学さんマ , の遺 O P Aq tu u a re 2002 2) p o le o ri Y w at e r n li ni c al to a s ui - u c c m M E , h e ag e S hi n k u u g el n a n n e di c i n G JH u a p o 7 ) . , I 4 a n d o H of s u M MI W C B , A a n n eu ro m d u sc u - 4 ) ロンジイェクシ a an d Ag , h c S g c e g A gi V g B k m a n er 199 8 d V 4 9 ) . J Cli n s te b m ln er e , e r w e e n W B d ∫ P b y si o1 , O tt e N i el s ic rs e n S: e n s t ru c 54 2 : 3 - - 1 6, Y a n a T , T as e t lo - e m b A at s u an d O tt e l p U , a n d O tt k k h G k o u , O P: r at e r e s si o n in i N J e u r o sc il t o m l t m D an h M a s hi T s B ph a R . ∫ p pb a i e - o r n . e c o m g PI e b i n a ti o n 4 67 - 486 1 5 0: o . e n oty p e u a q a c t e ri o Ⅰ u e s l a c ki n g t h l : . of in E p st ein CJ , an n e I B i o1 J n l og o a . d 19 97 , hi m li z a ti o o m EJ o u se c n n a w as O C a J 1 99 5 , a r s o n 962 - K , l h w at e r e b i n ati o . . F M g er se n p . an n e e n e r a ti o n n o c d Ⅲa e s a u d g l a n d u l a r ti s s C , 1 0 0: 95 7 P S it r ot ei n i n th ex A S: I m a n pi e A iti v an H , r ot ei n is hi F m e n an s n e r . P d , rse n in e a n n e R z e ar a , . Y g a w a T a m u ra h ir K ob a y , F o ffi c i e n t ar h M a st r o c y t e s pit h eli al r e c o m x h c l p c s e n s N o c lg i al . A S: v e st g yt ll i n t h a n n e w at e r G ill e , li z e d 1 7: o rp , re o u s M A a n n sg e ni c tra a s it e s p e c i五c at o m o m a n i トi n . n o a n Y , , e u r o s ci T p ol a ri n e rv e: Cu p m e rc u r a ンョ T of し直接御指導くださ , M , w at e r S d fi b r , r ∫ e n o rti n pp e n e r la N i el s ki M pp D r o w n M a m in c gh . e ci a . Ei d e t , , w at e r ro l o u O P: S p g ol d , ct u r a ru dd a P re th r gh o b r ai n ∫ N r at e r u , a n C , tr m u n o V p ti c ll s c e Fr i g e ir im EA s a w a N iel s n St : o n 1 0: 3 5 8 4 - 3 5 9 5 , 1 9 9 8 A E ri ll e r 1981 l s - fr e q e u r o s ci u s e ノッ細胞培養を担当 ES イク , a Ac , . lb u N , S a n , T g et e d m u a n az a k i ∫: E O f ES Th e u s e g n: yl a ti o O h n i s hi M S M iy t a ti o e n , ki T su zu d s c r e e n ln 也 e p ol y a d ig n s e ni c R l n a , ce of a s a b K , o M n ric h ll s , m b ay Y a g ati v e as hi gi T e nt c o nt ai ni n D T I A g n e o e n e a n , d g a w it h l e cti o s e n . Am i r y m g I S, Y n j iy o s h i F , Ki , 199 7 , k 発現 re 1 0) P n i - 4 in 1 8: 2 5 0 6 - 2 5 1 9 参考文献 ) Agre N g lh a a . J e b et 1 l u ti o , ti T a n s p o rt rs e n w at e r r C ell S ci 1 0 8 ( n 9 ) : 2 9 9 3 - 3 0 0 2 た夏目理恵さんっ a M が有用ナルョ u r , . 崎村建司教授に深く感謝いたしますた fo u ap o r n r e ss p r e ti n a めには作製を指導してくださっー著さん明石 , i S ex N Aq A Q P 4 の脳機能におけるクタベ s a m r e so hi Y e a Am i r y - M , d O 仕e an n s q i Y u m E 1 脳高次 , 系統ンディシ 6) 優れ , 系統を C 5 7 B L/ 6 系統コウマ辞タ T ak U 8 っ ) の担う Q P 4 遺伝子機能解析を行うた新たな知見を提供するだろう謝 a ai u a p o ri n C 57 B L/ 6 , アストロサイト特異的 C クアウトマウスの f o P r e o m e a r ウスと交配して得られるマ d とりわけした A Q P 4 - fl なるルと Ag , ra n e EA u s e s 遺伝子機能を解析する本研究で樹立 C g elh a o s e r m p l a z 4 0 7: 5 9 9 - 6 0 5 , 2 0 0 0 r e O P : S el e ct ty p たことからっにおける A Q P4 のー b N , . W , d F ujiy an w at e r . o u rq u e e m of 20 03 , H i r ai T , g el A n - 1 N at u S K a 方で遺伝子背景が重要でた遺伝子背景だと考えられるなツ p E , k o ts a n c e にマめられた異常が認スに戻し交配することにより A 機能すでが A Q P 4 は蛸牛に発現していることかこのことは, は A Q P4 ll K O C D - 1 , を C 5 7 B L/ 6 このマウス . スに戻し交配すると聴覚のこ n u しては JB o rin e n M it u , an n in u a q K r m . 系統の遺伝子背景を持つある m y N i el s m A QP4 の e u r o s c u r at a H 相同の M 月 11 i 4: 99 1 - 1 001 N ev d et e 組み換え効 , 細胞中で ES , 3 ベ , 相同組換え領域の長さに強く依存するの R とができこ平成 1 7 年 ( 2 00 5) 第 11 号 cu M o l ar b gh a dd a si s o f a m M w at e r a n d O tt ers e n t r a s p o rt i n O P: T h 血 e b r ain . N e at k e r l l ) K it a y a m m ar . T a ra n s K , g Ab e M e s , 8: 215 I 221 K a ki z al d T , , 1999 H . o n m a D , アクアポリン 4 菅井 : N at u m e R C e ll - S p S y st e m Bio ch e m 20 01 1 2) N a g F uk , a e c i 丘c a n G u ci d fr R s o m d S a ki m bl e G u r a R e n e m u n P : u r k i nj e b i n ati o e c o m C 5 7 B L/ 6 M e s c o m K ES o u s e T , I c h ik Y n ll c e 281: 1134 - 1140 . , as a w a M S ak i , e n r a n i N a a m a n d c N M D A o u se B E m N , h n R e s u r a b k in , r e ce M s M , N A an a pto , r , ri K J B e d ell M A h , d M is b in al l o c 1 996 be T o an ro m o s o m 36: 1 1 11 K K m u r a c M a ali z a ti o l an n e su b e n e of th n u n G : , it s . M e I o m a le o b e s bi c u d le E . V e Ki y , T m a of t 67 1 u r n c e J 血 N Ia n i Y a m a S , a n o ri M , h ip p s e n s o ri m t el e a ∫a n d e m a n Ⅳ l a c ki n g Cb R a w a a n c e m e n e m o 1 4) u ウスの作成マ l a c ki n g s t r u ct u r e k d l nd a . , 1 3) an e n e r at e Biopb y C o p el a n d N G J m M y 遺伝子欠損誘導型 p h al o n - W at a n a b e M , M a m iy a a n , d T a a ti n g in , - 4 m p air e d b w at e r c 2 7 6: 3 1 2 3 3 - 3 1 2 3 7 , 2 0 0 1 17 h In o u e a M t a nt ll i丘c sp e c e dh a c e i 1 3: 1 79 - 1 8 9 A S: I , : r ef e r e n c e m u e u ro s c aq u ap o r n e T gi M i sb i n p l IJ P a g ( 平成 . M o H o c a m ot o r b , m a ri n g i n l . e e si o n 2 00 1 an n e s ic ∫ . m ic e B i oI . 年 1 月 2 1 日受付)