Western Blot

Western blotting Protocol 2015.Feb 改訂版【タンパク質回収】６well プレートにて培養した細胞から回収する場合： 1) PBS にて wash。 2) Homogenization Buffer を 500 µL ずつ加える。 3) ピペットにて細胞を剥がし、1.5 mL チューブに回収する。［Homogenization Buffer］ 1 M Tris-‐‑‒HCl (pH 7.4) 5 mL 3 M NaCl 5 mL Triton X-‐‑‒100 1 mL H2O Sodium Deoxycholate 87.7 mL 2.5 mg/mL ※ Protein Inhibitor (nacalai tesque #25955-‐‑‒11) ※ : 使⽤用する直前に加える。 Protein inhibitor は使⽤用する量量に対し、200 倍希釈 4) 15 秒×7 回、超⾳音波処理理を⾏行行う。 5) −80℃にて保存する。 ※ 【タンパク質定量量】 BIO RAD DC プロテインアッセイ (#500-‐‑‒0116) を使⽤用する。 1) BSA を H2O に溶かし、以下の濃度度のスタンダードを作成する。 (2.0 mg/mL, 1.0 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0 mg/mL) 2) A 試薬 1 mL あたり S 試薬 20 mL を加えた Aʼ’試薬を必要量量作成する。 3) 1.5 mL チューブにスタンダードおよびサンプルを 20 µL ずつ⼊入れる。この際、スタンダードは n=3 で実施する。 4) Aʼ’試薬を 56 µL ずつ加え、軽く混合する。 5) B 試薬を 445 µL ずつ加え、転倒混和した後、室温にて 15 分間インキュベ
ートする。 6) 吸光度度計(SmartSpecTMPlus, BIORAD)で 750 nm の波⻑⾧長を測定する。 7) スタンダードの各濃度度の平均値から検量量線を求め、その式からサンプルのタ
ンパク質濃度度を計算する。【SDS PAGE】 1) 1.5 mL チューブに以下の通り泳動サンプルを調整する。サンプル 20 µg 相当 4× Laemmli Buffer 7.5 µL 1 M DTT 1 µL 泳動バッファー Up to 30.5 µL ［4× Laemmli Buffer］ H2O 10 mL 1 M Tris-‐‑‒HCl (pH 7.5) SDS 12.5 mL 4 g Glycerol 22.5 mL 0.2 % BPB 2.5 mL ［泳動バッファー］ 10× Tris/Glycine (Bio Rad #161-‐‑‒0734) H20 Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 50 mL 450 mL 0.5 g 2) 1〜～3 分、沸騰した⽔水にてボイルする。 3) 5〜～20 % 1.5 mm 厚のゲル (e-‐‑‒PAGEL, ATTO E-‐‑‒T520L)を泳動装置 (ATTO, #AE-‐‑‒6530M/P)にセットし、泳動バッファーを加えた後、コームを
抜き、各ウェルにシリンジとニードルを⽤用いて、泳動バッファーを⾏行行き渡ら
せる。 4) 各ウェルにサンプルとマーカー (Wako, #230-‐‑‒02461)をアプライする。 5) サンプル中の BPB がゲルの下端に到着するまで電気泳動を⾏行行う。 (泳動装置: myPowerⅡ300, ATTO #AE-‐‑‒8135) (泳動条件: C.C 30 mA, MAX 300 V) 【Blotting】 1) SDS-‐‑‒PAGE が終了了後、ゲルを壊さないよう、丁寧に泳動装置から外し、スパ
チュラを⽤用いてガラス板の⽚片側を外す。 2) Blotting Buffer を満たしたタッパーにゲルが浸るようにガラス板を浸し、
表⾯面張⼒力力を利利⽤用するようにゲルを上げ下げしながら丁寧に剥がす。［Blotting Buffer］ H2O 700 mL 10× Tris/Glycine (Bio Rad #161-‐‑‒0734) 100 mL Methanol 200 mL 3) 7.0 cm ×8.5 cm のメンブレン (Immobilon-‐‑‒P, Millipore #IPVH00010)
を 100 % タッパー内でメタノールに浸し、1 分程震盪した後、Blotting Buffer に浸して震盪しながらよく馴染ませる。 4) ろ紙 (Whatman, GE Healthcare, #3017-‐‑‒915) を 10 cm×10 cm で切切り、
2)で Blotting Buffer 内に浸っているゲルの下に⼊入れる。 5) ろ紙の上にゲルを乗せたまますくい、以下の通り、Blotting ⽤用のカセットを
作成し、Blotting 装置 (ATTO, MODEL WSE-‐‑‒3500)にセットする。 6) 装置に Blotting Buffer を⼊入れ、
C.V 45 V にて 2 時間ブロッティングを⾏行行う。 7) ブロッティング後、タンパクのある⾯面が分かるようメンブレンの⾓角に切切れ込
みを⼊入れ、Blotting Buffer を満たした状態のビニールに⼊入れシーラーにて密
封し、−20℃にて保存する。【Blocking】 1) 凍結してあるメンブレンを解凍する。 2) 四⾓角シャーレに 10 mL の Blocking Buffer を⼊入れ、メンブレンを浸す。［Blocking Buffer］ 1× PBS 100 mL Skim milk 3.0 g Tween 20 50 µL ※ 本プロトコルでは 3 % skim milk, 0.05 % Tween20 PBS で⾏行行っているが、⽤用いる抗体などの条件によって skim milk と Tween20 の濃度度は調整が必要である。 3) 穏やかに震盪しながら室温にて 1 時間インキュベート。［抗体処理理］ 1) ⼀一次抗体を Blocking Buffer 10 mL にて希釈する。［抗体希釈］ α-‐‑‒tubulin (Santa Cruz, sc-‐‑‒32293) 1 : 1000 Cyclin D1 (MBL, # 553) 1 : 5000 CDK4 (MBL, #K0065-‐‑‒3) 1 : 2000 2) blocking 後、Blocking Buffer をアスピレートし、⼀一次抗体反応液を⼊入れ、
メンブレンを浸し、室温で 1 時間震盪する。 3) 抗体反応液をアスピレートし Wash Buffer を 10 mL ⼊入れ震盪しながら５分
間 wash する (3 回繰り返す)。［Wash Buffer］ 1× PBS 200 mL Tween 20 100 µL ※ 本プロトコルでは 0.05 % Twee 20 PBS だが、結果でバックグラウンドが⾼高い場合などは Tween 20 の濃度度を上げても良良い。 4) ⼆二次抗体を Blocking Buffer にて希釈しする［抗体希釈］ HPR-‐‑‒anti-‐‑‒IgG Ab (GE Healthcare, NA931V or NA934V※) 1 : 2000 ※ ⼀一次抗体のホストが mouse か rabbit によって違うため、注意すること。 5) wash 後、希釈した⼆二次抗体を 10 mL ⼊入れ、1 時間室温にて震盪する。 6) Wash Buffer 10 mL にて 10 分間室温で震盪し、wash する (3 回繰り返す)。
【タンパクの検出】 1) ECL detection reagent (GE Healthcare, #RPN2109)や Pierce Western Blotting Substrate (Thermo, #NCI3109)のといった化学発光検出試薬を
プロトコル通り使⽤用 (A 液、B 液を等量量ずつ混合)し、メンブレンを 1 分間浸
して反応させる。 2) LAS4000 mini にて感光し、検出する。

Download Report