ナノミセル型ｓｉＲＮＡ送達システムの開発ステムとしての要件を充分に満足させる事が可能である。実施予定期間：平成 17 年度～平成 19 年度既に、制ガン剤（アドリアマイシン、パクリタキセル）を研究代表者：片岡一則（東京大学大学院工学系研究科内包した血中滞留型ナノミセル製剤が我が国（国立がんセマテリアル工学専攻・同医学系研究科臨床医工学部門）ンター中央病院）において臨床試験に進むなど、実用的な共同研究機関：（株）ジーンケア研究所 DDS として大きな注目を集めている。また，プラスミド DNA を内包するナノミセルについては、遺伝子送達システムと 1. 共同研究の目標についてしての優れた特長が見出されており、in vivo における有本共同研究の目標は、臨床応用へ向けた siRNA 送達システ効な遺伝子導入と治療効果の確認が既に達成されている。ムの開発である。高分子のナノ集積手法に基づいて創出さ本申請課題に直接関連する siRNA デリバリーへの展開にれたナノミセル型薬物送達キャリアを、近年のバイオテクついても、以下に詳述する二つの系で、ナノミセル型キャノロジーの進展に基づいて発見された画期的な核酸医薬リアを用いた有効な in vitro 遺伝子ノックダウンを確認である siRNA の送達システムへと応用することによって、している。「必要な時（timing）に、必要な部位（location）で、必 a. 内核構成連鎖の精密構造設計に基づくインテリジェン要な治療（action）」を最小限の副作用で達成する「ナノト型ナノミセルキャリアの構築治療システム」を開発する。対象疾患としては、日本国民 1 つのモノマーユニット内に塩基性度の異なる 2 つ以上のの死亡原因の第１位であり、有効な治療法の確立が強く望アミノ基を規則正しく配置したポリカチオンセグメントまれている「難治ガン」治療を目標とし、動物モデルでのをナノミセルの内核構成連鎖とするブロック共重合体を薬効の評価と、高分子ナノテクノロジーを駆使したナノミ設計する事によって、1)安定な siRNA 担持機能と 2)効率セル型キャリア・デザインの行程を緊密な産学連携の元に的な細胞質内輸送のためのエンドソーム溶解機能という進めることによって、３年後には臨床応用可能なシステム２つの機能を両立させたインテリジェント・ナノキャリアを構築する。システムの構築を行った。この様なナノミセル型キャリアを用いて、培養細胞に対する siRNA 導入を行う事によって、 2. 共同研究計画・内容（手法も含む）についてナノミセル型薬物送達システムは，経費受給機関代表者従来、困難とされていた血清タンパク質共存下においても、内在性遺伝子を含めた効率的な遺伝子ノックダウンを導である片岡（東京大学大学院工学系研究科・同医学系研究く事に成功した（K. Itaka，K. Kataoka, et al; J. Am. Chem. 科）（以下東京大学）が世界に先駆けて独創的に開発を進 Soc.; 126:13612-13613 (2004)）。めてきたものであり、親水性かつ生体適合性のポリエチレ b. PEG-siRNA 結合体（PEG-siRNA コンジュゲート）を内包ングリコール（PEG）鎖を含むブロック共重合体の多分子するナノミセル・システムの構築会合によって形成される高分子ミセルを、ナノスケールの細胞内ミクロ環境(エンドソーム内酸性環境および細胞輸送キャリア（ナノキャリア）として用いるシステムであ質内還元的環境)で選択的に開裂する化学結合(エステルる。ナノミセルは薬物を含有する内核の周囲を PEG の外殻結合およびジスルフィド結合)を介して連結したポリエチが取り囲むという明確な二層構造を有しており、粒径はレングリコール(PEG)-siRNA コンジュゲートを合成し、血 50～100nm と、天然のウィルスに類似した大きさと形態を流中における安定性の向上と細胞内での siRNA の効率的持った、いわば人工ウィルスとも呼ぶべき新規ナノキャリな機能発現を実現するための新しい分子設計を行った。ア・システムである。このシステムは、1)抗原性，細胞毒 PEG-siRNA コンジュゲートは任意のポリカチオンと混合す性がほとんど無く安全性に優れる、2)生理的環境下でも非ることにより、高分子ナノミセルを形成することが可能で常に安定である、3)細胞表面受容体などへの結合性の高いある。この高分子ナノミセルは、数 nM の極めて低い siRNA リガンドやペプチドをミセル外殻へ連結することが可能濃度においても非常に高い遺伝子ノックダウン効果を示で、標的細胞に対する特異性を高めることが出来る、4) すことが明らかとなった(M. Oishi，K. Itaka，K. Kataoka 外部環境に応じた薬物放出特性を実現（インテリジェント et al; J. Am. Chem. Soc.; 127:1624-1625 (2005))。さ性）出来るなどの特長を有しており、理想的な薬物送達シらに、この様な高分子ナノミセルは、PEG 末端に導入したリガンド分子(ラクトース)を介して細胞内に取り込まれ、性化が可能となることであり、市販の培養細胞のための siRNA 活性が著しく増強されたことから、in vivo におけ siRNA 導入剤により数 10nM で遺伝子の不活性化効果が確る標的選択的 siRNA 送達システムとしての有効性が強く認されることから、ナノミセル型 siRNA キャリアにおいて期待される。はより低濃度域での有効性を目標とする。また蛍光標識を以上の様な成果を基盤として、本共同研究では、ナノミセ利用して siRNA の取り込み量や細胞内挙動を定性的かつル型 siRNA 送達システムの in vivo 治療への展開を推進す定量的に解析し、siRNA の効率的な細胞内デリバリーのたる。すなわち、臨床応用に向けたリードオプティマイゼーめにキャリアに必要とされる基本特性を明確にする。ションを目的として、共同研究機関である株式会社ジーン (3) ガン細胞パネルを用いた制ガン siRNA 内包ナノミセケア研究所（以下，ジーンケア）が開発した制ガン siRNA ル型キャリアの増殖抑制評価試験（ジーンケア）を用いた機能評価を行う。ガンは依然として日本国民の死上述で設計されたナノミセル型 siRNA キャリアの種々亡原因の第１位であり、有効な治療法の確立は我が国が解のガン細胞の増殖に対する影響を調べる。検討の対象とな決すべき最重要課題の一つである。ジーンケアでは、早老るガン細胞としては、肺ガン、乳ガン、大腸ガン、前立腺症ウエルナー症候群の原因遺伝子である WRN ヘリカーゼガン、子宮ガン、肝ガン、膵臓ガン等由来のガン細胞パネ及び、WRN ヘリカーゼが属する RecQ ヘリカーゼファミリル３０株以上を予定している。これより、siRNA キャリアーに対する siRNA が、ガン細胞特異的にアポトーシスを誘の有効濃度域を種々の培養細胞に対して明らかにし、担ガ導し死滅させる事実を見出した。これはヒト RecQ ヘリカンマウスによる制ガン効果の検討に用いるガン細胞とーゼファミリーが制ガンの優れた標的であることを証明 siRNA キャリアの組み合わせを決定する。またガン細胞種すると同時に、ガン細胞特異的にアポトーシスを誘導するの違いによる適切なデリバリーキャリア設計を行うため siRNA そのものが、制ガンの優れたシーズであることを示に、デリバリー効率が低いガン細胞種を同定する。す（株式会社ジーンケア研究所、特許出願中）。本共同研 (4) 担ガンマウスを用いた制ガン siRNA 内包ナノミセル究では，ナノミセル型 siRNA キャリアの in vivo 送達シス型キャリアの制ガン効果評価試験（東京大学、ジーンケア）テムとしての機能評価を、担ガンモデルマウスを使った動ガン細胞パネルを用いた実験により決定された、ガン細物実験により行う。具体的な研究計画としては，以下の通胞とナノミセル型 siRNA キャリアの組み合わせを用いて、りである。 in vivo での制ガン効果を検討する。ヌードマウスにヒト (1) ナノミセル型 siRNA キャリアの設計と in vitro 機能ガン細胞を皮下移植し、生着を確認した後に RecQ ヘリカ評価（東京大学）ーゼファミリー遺伝子に対する siRNA を内包したナノミ標的となる種々のガン細胞に対して、siRNA の遺伝子ノッセル型キャリアを投与し、腫瘍サイズ，腫瘍体積，体重のクダウン効果が最も効率よく得られる高分子構造の検討測定を行う。また腫瘍部分におけるアポトーシスの誘導をを行う。高分子構造、高分子鎖長、および siRNA との混合検証する。既存の制ガン剤であるシスプラチンやドキソル荷電比のわずかな違いで、形成されるキャリアの物性、生ビシン等と比較して、有効投与量や投与回数の低減、なら物学的機能は大きく変化することが想定されるため、ナノびに副作用の軽減を指標として有効性を検証する。また、ミセルの物性評価並びに in vitro 機能評価を通じて、生体内イメージング装置（IVIS、東京大学に設置済み）と siRNA キャリアとして最適の構造を絞り込んで行く。また、ルシフェラーゼを安定発現するガン細胞株の組み合わせ in vitro 無血管腫瘍モデルである培養ガンスフェロイドを用いる事によって、転移ガン治療への有用性についてもを用いて、腫瘍縮小効果の時間依存性並びにナノキャリア検討を行う。のガン組織内浸透性を詳細に評価し、最適ナノキャリアサ (5) siRNA キャリアの毒性・薬理・薬物動態試験（ジーンイズと siRNA 放出特性の関係を明らかとしていく。ケア） (2) 制ガン siRNA を内包したナノミセル型キャリアの in 厚生労働省の定めるプロトコルにより行う。毒性が極めて vitro 活性評価（東京大学、ジーンケア）低く、血中において１０時間以上の滞留能をもつことを指 RecQ ヘリカーゼファミリー遺伝子に対する siRNA を内標にしたナノキャリアシステムの最適化を行う。包したナノミセル型 siRNA キャリアの in vitro での薬理 (6) 臨床試験（ジーンケア）活性を、詳細に検討する。ナノミセル型 siRNA キャリアの厚生労働省の定めるプロトコルにより行う。制ガン siRNA 基本的なコンセプトは、in vivo で治療分子を患部に効率内包ナノミセル型キャリアについては、一種類以上のガン的かつ選択的にデリバリーすることで薬効を改善するこ種において制ガン作用を確認する。また本研究課題は、最とであるが、siRNA 分子の安定化，細胞内取り込みの改善終的には大手製薬企業と一定の契約を結び、これに基づいおよび細胞内環境に応答した siRNA 分子の放出により、in て臨床応用に向けたガン治療薬の開発を行うことを前提 vitro での siRNA の薬効が大幅に改善される可能性がある。としているため、知的所有権の形成についても東京大学と siRNA の最大の特徴は、極めて効率的な標的遺伝子の不活連携して積極的に進める。 3. 共同研究の必要性について企業の国際的活躍へとつながることが期待される。さらに siRNA による遺伝子ノックダウンは、「PCR 以来の画期は、大学とベンチャー企業から生まれた独創性高い成果が的技術」といわれ、その疾患治療への応用は強く実現が求高付加価値製品として実用化されるというプロセスを通められているものである。本共同研究で用いる RecQ-siRNA じて、起業マインドに溢れた若い研究人材が育成されるとはガン細胞を効率よくアポトーシスに導く画期的医薬品いう点も大きな波及効果として位置づけられる。候補であり、医薬品に極めて望ましい性質を兼ね備えた夢の治療薬となる可能性を秘めている。 5. 共同研究により期待される成果及びその活用方法につ一方、臨床への siRNA の応用には、安全かつ効率的なデリいてバリーシステムの確立が非常に重要となる。標的とする細本共同研究は、総合科学技術会議においても重点研究項目胞へのみ確実に siRNA を送り届けるターゲティングのみに挙げられている「ナノ DDS（ドラッグデリバリーシステならず、適切な時期に適切な遺伝子を発現させる、またはム）開発」の最前線に位置するものであり、その成果は広抑制するという、状況に応じた空間的・時間的機能制御のくナノバイオ産業の推進と国際競争力の強化に資するも可能なシステムが望まれる。そのための siRNA デリバリーのと考えられる。医薬品開発において圧倒的優位にある米システムの開発は、対象疾患の治療に最適な siRNA を設計国においても、ナノテクノロジー国家戦略において、将来するバイオテクノロジーと、その様にして設計されたを見据えた研究目標の一つに「標的治療を可能とする遺伝 siRNA を標的部位・細胞に輸送するナノキャリアを構築す子や薬物デリバリー」を掲げ、積極的な取組みを行っているためのナノテクノロジーという両先端分野の高度な次る。我が国は、ナノテクノロジー・材料技術で米国をはじ元での融合が不可欠であり、両分野で高い実績を有する研めとする先進各国に対する優位性を有しており、本申請が究機関（東京大学とジーンケア研究所）の緊密な連携の元目指す様なナノテクノロジーを活用した革新的な担体材での共同研究が必要となる。料の開発を集中的に実施することによって、ナノバイオ産業分野における国際競争力の強化を図ることが出来る。ま 4. 共同研究の社会・経済の発展等に対する波及効果につた，本共同研究から生み出される知的財産は、様々な siRNA いてに基づく治療へも活用されることが期待され、社会的・経本共同研究が目標とする臨床応用可能なナノミセル型済的に大きな効果をもたらすことが確信される。 siRNA 送達システムの実現は、核酸医薬を用いた革新的ガン治療領域を確立するキーテクノロジーであり、多くの難 6. 生命倫理・安全面への配慮について治ガン治療を通じて高い社会的貢献をもたらすことが期動物実験は、国の「動物の保護および管理に関する法律」待される。さらに、本研究成果はガンの他、C 型肝炎などなどに従い、動物愛護の観点に十分配慮して行う。東京大の感染症、循環器疾患、遺伝子疾患などの難治性疾患に対学での当該動物実験は東京大学動物実施マニュアルと NIH する有効かつ副作用のない治療法を提供するものであり、ガイドラインに則って行われ、動物愛護の立場から必要最我が国の医療・福祉水準の向上に計り知れない貢献をもた小限に留める。また、本研究の実験内容が含まれる動物実らすと同時に、ナノテクノロジーと高度医療との融合に基験計画書は、東京大学動物実験専門委員会に承認済みであづく「ナノ医療」という新領域創成をも促すものである。る。一方、経済面からの波及効果としては、夢の新薬として各方面から期待されている siRNA の実用化を通じて、ナノバイオを基調とする新医療産業の発展を先導し、かつ、その様な産業活動の中核となる我が国発のバイオベンチャー 7. 実施体制氏名 ◎○片岡所属機関・職名一則東京大学・教授提案課題における役割経費受給期間代表者、siRNA キャリア設計・合成責任者 ○ 西山伸宏東京大学・講師 siRNA キャリア機能評価責任者山崎裕一東京大学・准教授 siRNA キャリア設計・合成参画者長田健介東京大学・講師 siRNA キャリア設計・合成参画者 Lee Yan 東京大学・特任教員 siRNA キャリア設計・合成参画者 ○ 古市泰宏 (株)ジーンケア研究所・代表取締役会長共同研究機関代表者、制ガン活性評価責任者 ○ 二見和伸 (株)ジーンケア研究所・研究員 siRNA 検出系、配列スクリーニング責任者制ガン活性試験参画者平井美和 (株)ジーンケア研究所・研究員制ガン活性試験参画者 8. 各年度の計画と実績いては、ナノミセルの希釈に対する安定性が重要であると a.平成 17 年度考えられ、siRNA の活性のみならずナノミセルの安定性を・計画十分に考慮したキャリア設計を行う。また、ラクトースリ PEG-ポリカチオンブロック共重合体の合成および siRNA ガンドに加え、種々のガン細胞に対する標的化を実現するコンジュゲートの合成を行い、siRNA 内包ナノミセルを調ために、多くのガン細胞で過剰発現が認められる葉酸や環製する。調製したナノミセルの物性評価ならびに生体内投状 RGD リガンドを導入したナノミセル型 siRNA キャリアの与を視野に入れた安定性試験を行う。また、ナノミセルの構築を行う。さらに、ナノミセル型 siRNA キャリアの体内 in vitro における機能発現をレポーター遺伝子を用いた動態を蛍光および放射性同位体でラベルした siRNA を用アッセイならびに RecQ を標的にした siRNA による細胞増いて行う。同時に、in vivo イメージングシステムを用い殖阻害実験により検討する。さらには、表面にラクトースた制ガン活性の評価系確立とルシフェラーゼ発現細胞を分子を導入した siRNA 内包ナノミセルを開発し、ラクトー用いた制ガン活性を進める予定である。スに対する受容体を発現する肝ガン細胞に対する有効性・実績を確認する。・実績 PEG-ポリカチオンブロック共重合体から形成されるナノミセルに関しては、その構造安定性を高めるために、側 PEG-ポリカチオンブロック共重合体から形成されるナ鎖にカチオン性イミノ基とチオール基を導入し、内核がジノミセルに関しては、物性評価を通じてナノ粒子形成のたスルフィド結合により安定化されたsiRNAナノミセルを構めのナノミセル調製条件を確立した。一方、PEG-siRNA コ築した(平成17年度に開発された架橋ミセルにはカチオンンジュゲートにより形成されるナノミセルの構造最適化性イミノ基が導入されていない)。この架橋型ナノミセルを行い、低濃度で高い siRNA 活性が得られることを確認しは、非架橋型と比較してsiRNA活性が100倍以上に高まるこた。PEG-siRNA コンジュゲート型ナノミセルについては、とが確認された。リガンドの導入に関しては、モデルとし in vitro 無血管腫瘍モデルとして培養ガンスフェロイドて蛍光標識DNAを内包した環状RGD装着型ナノミセルを構に対する siRNA の活性評価を行ったところ、RecQ を標的築した。環状RGD装着型ナノミセルは、環状RGD非装着型とにした siRNA を用いることにより、有意なスフェロイドの比較して、迅速に細胞内に取り込まれ、異なる細胞内動態増殖抑制活性が得られることを確認した。一方、汎用 siRNA を示すことが明らかとなった。導入試薬であるオリゴフェクタミンを用いた場合には、 PEG-siRNAコンジュゲートとポリカチオンから形成され siRNA の導入によるスフェロイドの増殖抑制活性が確認さるナノミセルに関しては、前年度までにHuH-7細胞からなれなかった。るスフェロイドに対するRecQ標的siRNA内包ナノミセルの b.平成 18 年度高い抗腫瘍活性が確認されたために、本年度は、HuH-7を・計画皮下に移植したマウスを用いてin vivoにおける制ガン活平成 17 年度に得られた結果より、さらに優れた siRNA 性を評価したが、有意な治療効果は得られなかった。そこ活性を実現するために、ナノミセル型キャリアの構造最適で、32Pで標識したsiRNAを用いて体内動態評価を行ったと化を行う。とりわけ全身投与による siRNA デリバリーにおころ、血中濃度および組織への集積においてナノミセルと PEG-siRNAコンジュゲート単独との間に明確な差は認めらが認められたために、本年度は種々のガン細胞を用いてスれなかった。この結果は、PEG-siRNAコンジュゲート型ナフェロイドの調製を試みたが、siRNAの活性評価が可能なノミセルは、血中における安定性に乏しく、速やかにスフェロイドを構築することができなかった。これは、ス PEG-siRNAコンジュゲートへと解離していることを示唆しフェロイドの構築が細胞種に依存することによるものとているものと考えられる。本システムについては、平成19 考えられる。年度以降に、ミセル構造を安定化させるための分子設計を c.平成 19 年度行っていく予定である。一方、in vivoイメージングシス・計画テムによる制ガン活性評価については、ルシフェラーゼ発平成 17、18 年度に得られた成果を基盤として、最適化現がん細胞を作成し、in vitroで有効に機能することを確されたナノミセル型 siRNA キャリアに環境応答機能と標認した。本手法は、ナノミセルの機能評価に活用する予定的認識機能を導入し、さらなるインテリジェント化を図る。である。ナノミセル型 siRNA キャリアの機能評価は、担ガンマウスさらに本年度は、RecQL1を標的とするsiRNA配列の最適を用いた動物実験により行い、体内動態と制ガン活性の両化を行った。この選抜した配列を用いて、ガン細胞パネル方において優れたナノミセルを開発する。さらに、ナノミで活性評価を行った。一方、平成17年度の成果報告書に記セル型 siRNA キャリアの安全性についても検討を行う予載したように、HuH-7細胞からなるスフェロイドに対して定である。 PEG-siRNAコンジュゲート型ナノミセルの高いsiRNA活性 9. 年次計画共同研究の実施機関１年度目２年度目３年度目ブロック共重合体および siRNA コンジュゲートの合成ブロック共重合体および siRNA コンジュゲートの合成ブロック共重合体および siRNA コンジュゲートの合成とナノミセルの構築 15 (百万円) 15 (百万円) ナノミセルの物性評価ナノミセルの in vitro 機能評価 7 (百万円) 6 (百万円) ナノミセルの in vitro 機能評価イメージング装置による siRNA 活性評価 16 (百万円) 3 (百万円) 東京大学 10 (百万円) ナノミセルの体内動態評価 15 (百万円) 担ガンマウスによる制ガン活性評価 5 (百万円) 担ガンマウスによる制ガン活性評価 15 (百万円) 株式会社ジーンケア研究所ナノミセルの毒性，薬理，薬物動態試験ナノミセルの毒性，薬理，薬物動態試験 siRNA 検出法の開発担ガンマウスによる制ガン活性評価担ガンマウスによる制ガン活性評価新規制癌標的分子同定ガン細胞パネルを用いたキャリア封入 siRNA の活性試験ガン細胞パネルを用いたキャリア封入 siRNA の活性試験配列ｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ