核内チロシンキナーゼによる KAP1 のチロシンリン酸化を介したクロマチン構造制御メカニズムの解析 2014 年千葉大学大学院医学薬学府先端生命科学専攻ゲノム機能学講座分子細胞生物学研究室久保田翔 Contents Introduction ····················································································································· 2 Results ···························································································································· 3 Discussion ························································································································ 7 Materials and Methods ········································································································ 9 References ······················································································································ 11 Figures··························································································································· 16 List of Publications, Examiners ····························································································· 17 Acknowledgements············································································································ 18 1 Introduction チロシンキナーゼは、細胞の増殖・接着・分化などに関わる様々なシグナル伝達において重要な役割を担っている (Hubbard and Till, 2000; Hunter, 2009)。非受容体型のチロシンキナーゼは主に細胞膜近傍に局在しており重要な機能を果たしていることが知られているが、核内における機能についてはわかっていないことが多い (Cans et al., 2000; Moorhead et al., 2007)。当研究室では、非受容体チロシンキナーゼであるSrc 型チロシンキナーゼ (SFK) の一部が核内に局在していることを報告している (Ikeda et al., 2008; Takahashi et al., 2009)。また、非受容体型チロシンキナーゼの c-Abl は細胞質と核を行き来していることが知られており (Taagepera et al., 1998)、受容体型チロシンキナーゼの ErbB4 はリガンドからの刺激によって、細胞質内領域が切断され細胞質と核に局在することが知られている(Ni et al., 2001)。クロマチンは DNA とヒストンからなる複合体であり、主にユークロマチンとヘテロクロマチンという２つの構造からなっている (Lamond and Earnshaw, 1998)。ユークロマチン領域ではクロマチン同士がゆるく結合しており、転写が活性化されている。逆にヘテロクロマチン領域ではクロマチン同士が密に結合しており、転写が不活性化されている。クロマチンの構造を制御することは、転写の制御などを介して細胞の機能を調整する上で、非常に重要である。当研究室では核内におけるチロシンキナーゼの機能について研究を行っており、SFK や c-Abl, ErbB4 などのチロシンキナーゼの活性化がクロマチン構造の変化やヒストン修飾などに影響を与えることを見出してきた (Yamaguchi et al., 2001; Nakayama and Yamaguchi 2005; Takahashi et al., 2009; Aoyama et al., 2011; Ishibashi et al., 2013)。これらのチロシンキナーゼに核局在シグナルを付加すると、クロマチンの構造が大きく変化する。しかし、核内においてチロシンキナーゼがどういったタンパク質のチロシンリン酸化を行なうことで、クロマチン構造の制御に関わっているのかその詳細な分子メカニズムについては未だわかっていない（図 1）。そこで、私は核内チロシンリン酸化シグナルによるクロマチン構造制御のメカニズムを解明するために、核内チロシンリン酸化基質の探索をおこなった。そして、様々な核内チロシンリン酸化基質を同定することができた。その中でも私は、ヘテロクロマチン構造に関わるタンパク質として KAP1 というタンパク質に着目した。そして、KAP1 のチロシンリン酸化部位を同定し、KAP1 のチロシンリン酸化による機能の変化について解析した。 2 Results 核内チロシンリン酸化基質の同定核内に存在する Lyn によって起こるクロマチンの構造制御の分子メカニズムの解明のために、当研究室で作成した HeLa S3/NLS-Lyn-wt の安定発現株を用いて、基質のチロシンリン酸化をウェスタンブロッティングで検出した。脱リン酸化酵素阻害剤である Na3VO4 を用いて、リン酸化を保存した状態で回収したところ、親株である HeLa S3 と比べてチロシンリン酸化のバンドのパターンに違いがあった (参考文献：Fig. 1C)。さらに、質量解析のために浮遊培養によって、細胞の大量培養を行った。そして、抗チロシンリン酸化抗体による免疫沈降にてタンパク質を精製し、CBB 染色で見える程度のタンパク質を集め、in gel digestion 法によってタンパク質を抽出し質量解析を行なった。その結果、KAP1 というタンパク質を同定することができた (参考文献：Supplemetal Table S2)。KAP1 はヘテロクロマチンの構造制御や転写の抑制に関わるタンパク質として知られている (Iyenger and Farnham, 2011)。 KAP1 のチロシンリン酸化 NLS-Lyn の安定発現細胞において Na3VO4 を処理した後、内在性の KAP-1 を免疫沈降したところ、 KAP-1 のチロシンリン酸化を検出することができた (参考文献：Fig. 1D)。また、COS-1 細胞に NLS-Lyn と KAP-1 を共発現させ、抗 Flag 抗体を用いて免疫沈降し、抗チロシンリン酸化抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なったところ、KAP-1 のチロシンリン酸化を検出することができた (参考文献： Fig. 1E)。しかし、KAP-1 と NLS-Lyn の kinase 活性の無い変異体である NLS-Lyn-Kinase Dead(KD)を cotransfection してもチロシンリン酸化は検出されず、Src 型チロシンキナーゼの阻害剤である SU6656 を処理したところ、チロシンリン酸化の減少が見られた (参考文献：Fig. 1E)。このことから、KAP1 は核内 SFK によってチロシンリン酸化されることがわかった。さらに、NLS を付加していない SFK によってKAP1のチロシンリン酸化が誘導されているかどうかを調べた。KAP1とSFKのメンバーであるc-Src, Lyn, Fyn をそれぞれ細胞に共発現させ、参考文献：Fig. 1E と同様に解析したところ、NLS を付加していない SFK によって KAP1 のチロシンリン酸化が検出された (参考文献：Fig. 1J)。さらに、SFK のメンバーの中では c-Src によって強くチロシンリン酸化誘導され、Fyn ではまったくチロシンリン酸化が誘導されなかった (参考文献：Fig. 1J)。我々は SFK 以外のチロシンキナーゼによっても、クロマチンの構造変換が起こることを報告している (Aoyama et al., 2011; Ishibashi et al., 2013)。そこで、 NLSを付加したErbB4 のIntracelluar domain (NLS-4ICD)、 Abl チロシンキナーゼ(NLS-c-Abl)、Syk チロシンキナーゼ(NLS-Syk) と KAP1 を共発現させ、参考文献： Fig. 1E と同様に解析したところ、それぞれのチロシンキナーゼで KAP1 のチロシンリン酸化が起こることがわかった (参考文献：Fig. 1I)。その中でも特に SFK と Abl によって KAP1 のチロシンリン酸化が強く誘導されることがわかった。 3 KAP1 のチロシンリン酸化部位の同定次に KAP1 のチロシンリン酸化部位の同定するために、KAP1 の部分欠損変異体の作製を行なった。 KAP1-N1 (1-469 a.a.), KAP1-N2(1-380 a.a.), KAP1-C(470-835)の3つの変異体を用いた。細胞にNLS-Lyn-HA と 3 つの変異体それぞれを共発現させ、抗 FLAG 抗体を用いて KAP1 を免疫沈降し、チロシンリン酸化を解析したところ KAP1-N1 のみで強いチロシンリン酸化が検出することができた。さらに、質量解析の結果から、Tyr-517 のチロシンリン酸化が起きていることが同定できていた（参考文献：Supplemetal Table S2）。このことから、Tyr-449, Tyr-458, Tyr-517 の３箇所が主要なチロシンリン酸化部位であることが考えられた。そのため、この 3 つのチロシン残基をフェニルアラニンに置換した KAP1-3YF 変異体を作製し、(参考文献：Fig. 2A)同様にチロシンリン酸化を解析したところ、KAP1 のチロシンリン酸化が消失した (参考文献：Fig. 2H)。また、参考文献：Fig. 1I で調べたほかのチロシンキナーゼによるチロシンリン酸化部位も同様であるかどうか調べた。Fig. 1I の複数のチロシンキナーゼを KAP1-3YF と共発現させ、参考文献：Fig. 2A と同様に解析した。その結果、ほかのチロシンキナーゼによるチロシンリン酸化も KAP1-3YF 変異体では消失していた。以上の結果から、Tyr-449, Tyr-458, Tyr-517 が、複数のチロシンキナーゼよってリン酸化される KAP1 の主要なチロシンリン酸化部位であることがわかった (参考文献：Fig. 2I)。 KAP1, HP1α のヘテロクロマチン領域への結合阻害 KAP1 は HP1α を含むヘテロクロマチンタンパク質と結合し、それらの足場となっていることが知られている (Lechner et al., 2000; Schultz et al., 2002; Zeng et al., 2010)。KAP1 のチロシンリン酸化によってどのような変化が細胞内に起こるのかを解析するために、まず KAP1 および KAP1 と結合するタンパク質である HP1α の局在を解析した。クロマチンに強く結合しているタンパク質の局在を解析するために、方法の項で述べる方法にて細胞を抽出してから、固定し染色を行なった。DNA の濃い染色領域であるヘテロクロマチン領域を解析したところ、KAP1, HP1α が主にヘテロクロマチン領域において共局在していることが観察できた。また、KAP1 をノックダウンしたところ HP1α がヘテロクロマチン領域から減少していることが観察された。このことから、HP1α がヘテロクロマチンに局在するために KAP1 が必要なことが示唆された (参考文献：Fig. 3A)。次にチロシンリン酸化シグナルによる KAP1 の機能変化を解析した。細胞内に NLS-Lyn を発現させたところ、KAP1 のヘテロクロマチン領域への局在が減少していることが観察された。また、HP1α の局在についても KAP1 と同様にヘテロクロマチン領域から減少していた (参考文献：Fig. 3B, C)。これらの結果から、核内チロシンリン酸化シグナルによって、KAP1, HP1α のヘテロクロマチンへの局在が 4 阻害されることが示唆された。顕微鏡で観察された結果を確かめるために、細胞を分画しそれぞれの画分のタンパク質を解析した。今回行なった細胞分画では、細胞質および核質のタンパク質画分である Low salt 画分、クロマチンにゆるく結合しているタンパク質画分である High salt 画分、クロマチンや核マトリクスに強く結合しているタンパク質画分である Insoluble 画分の 3 つに分け、解析を行なった (参考文献：Fig. 3D)。この方法にて分画すると、KAP1 の一部がヘテロクロマチンに強く結合しており、HP1α と同じ画分に検出されることがわかった (参考文献：Fig. 3D)。KAP1 の一部が強く密集しているヘテロクロマチンに結合することは、以前の報告とも一致している (Thruman et al., 2012)。この分画法にて KAP1 のヘテロクロマチンへの結合を解析したところ、 NLS-Lyn の発現によって Insoluble 画分でのKAP1 の量が減少した (参考文献：Fig. 3E)。また、Insoluble 画分での KAP1 の減少は NLS-Lyn(KD)では起きず、SFK の阻害剤である PP2 によって阻害されることから Kinase 活性依存的であることがわかった(参考文献：Fig. 3I)。さらに、HP1α について同様に解析したところ、KAP1 と同様の変化を示すことがわかった (参考文献：Fig. 3I)。これらの結果から、核内にチロシンリン酸化シグナルが伝達されることで、KAP1 と HP1α のヘテロクロマチンへの結合が減少することがわかった。KAP1 とヘテロクロマチンタンパク質との結合が減少しているかどうか確認するために、共免疫沈降によって KAP1 と HP1α およびヘテロクロマチンのマーカーであるトリメチル化ヒストン H3 (H3K9trime)との結合を解析したところ、チロシンリン酸化によって KAP1 と HP1α, H3K9trime との結合が減少していた(参考文献：Fig. 3L)。これらのことから、KAP1 がチロシンリン酸化されることによって、ヘテロクロマチンタンパク質との結合が減少し、ヘテロクロマチン構造が緩む可能性が示唆された。 KAP1 の Y449,Y458,Y517 のチロシンリン酸化と機能 KAP1 のチロシンリン酸化による細胞への影響を詳しく調べるために、チロシンリン酸化を受けない KAP1-3YF 変異体を用いて解析を行なった。内在性に発現している KAP1 をノックダウンした後、野生型の KAP1 (KAP1-WT) とチロシンリン酸化を受けない KAP1-3YF を、それぞれ発現するレスキュー細胞株を作製した (参考文献：Fig. 4A)。KAP1-WT と KAP-3YF の細胞株で、刺激を加えていない状態でヘテロクロマチンに結合している HP1α の量を比較したところ、KAP1-3YF の細胞株で HP1α の結合量が増加していることがわかった (参考文献：Fig. 4B)。参考文献：Fig. 3C で示したとおり NLS-Lyn の発現によって HP1α のヘテロクロマチンへの結合が減少していた。KAP1-WT の細胞株と KAP1-3YF の細胞株に NLS-Lyn を発現させ、参考文献：Fig. 3C と同様に解析したところ、KAP1-WT の細胞株では HP1α の量が親株の細胞と同様に減少するが、KAP1-3YF の細胞株では NLS-Lyn の発現による HP1α の減少が一部阻害されていることがわかった (参考文献：Fig. 4C)。また、核局在シグナルを付加していないが KAP1 のチロシンリン酸化を強く誘導する c-Src を発現させると、NLS-Lyn の結果と同様に、KAP1-WT の細胞株では HP1α の量が減少するが、KAP1-3YF の 5 細胞株では一部阻害されていた (参考文献：Fig. 4D)。しかし、KAP1 のチロシンリン酸化を誘導しない Fyn ではヘテロクロマチンと結合している HP1α の量は変化がなかった(参考文献：Fig. 4E)。 KAP1 は DNA 損傷応答の際に S473, S824 がリン酸化され、クロマチンとの結合が変化することによって p21 の転写を制御している (Ziv et al., 2006; Goordarzi et al., 2008; Lee et al., 2012)。また、SFK や c-Abl は DNA 損傷応答において活性化していることが知られている (Kharbanda et al., 1996; Baskaran et al., 1997)。そこで私は、DNA 損傷応答における KAP1 のチロシンリン酸化の影響に着目し、解析を行なった。細胞に DNA 損傷を引き起こす試薬であるアドリアマイシンを処理すると、KAP1-3YF 発現細胞では KAP1-WT 発現細胞に比較して S473, S824 のリン酸化が十分に起こらず、p21 の転写量が減少していることがわかった。このことから、KAP1 のチロシンリン酸化によるクロマチン構造の変化が DNA 損傷応答に関わっていることが示唆された。 6 Discussion 本研究によって、SFK や c-Abl などの複数のチロシンキナーゼが KAP1 の Tyr-449, Tyr-458, Tyr-517 という 3 つの共通のチロシン残基をリン酸化することがわかった。さらに、KAP1 のチロシンリン酸化が誘導されることで、HP1α のヘテロクロマチンへの結合が減少することがわかった (図 2)。 KAP1 の翻訳後修飾については、 Ser-473 や Ser-824 のリン酸化や SUMO 化などがすでに知られている。チロシンリン酸化についても PDGF 刺激で誘導されることや c-Fes によってチロシンリン酸化されることがわかっていたが、どの部位が主要なチロシンリン酸化部位でどのような機能を持っているかまったく未解明であった。当研究室では以前からクロマチン構造の変化と核内チロシンリン酸化シグナルの研究を行なっており、本研究ではその分子メカニズムを詳細にしらべるために、基質の同定を試みた。その結果、KAP1 のチロシンリン酸化の同定に成功した (参考文献：Fig. 1)。 KAP1 のチロシンリン酸化部位を推定するために網羅的な翻訳後修飾のデータベースである Phosphosite plus を参考にした。Phosphosite plus のデータベースでは主要なチロシンリン酸化部位として Tyr-458, Tyr-517 が挙げられているが、Tyr-449 についてはあまりチロシンリン酸化が検出されていなかった。本研究では、欠損変異体や点変異を用いた方法で Tyr-449 も主要なチロシンリン酸化部位の一つであることを示した (参考文献：Fig. 2)。 KAP1 はクロマチン構造を維持するタンパク質である。我々は核内チロシンキナーゼが KAP1 をチロシンリン酸化することでヘテロクロマチンとの結合が減少することを示し、HP1α もそれに伴ってヘテロクロマチンから減少することを示した (参考文献：Fig. 3)。以前の報告では、KAP1 のノックダウンによって HP1α の結合部位であるヒストン H3K9 のトリメチル化が減少することが報告されているが、我々の結果では、 KAP1 のノックダウンによって H3K9trime の減少は見られなかった (参考文献：Fig. 5A)。このことから、KAP1 は HP1α のヘテロクロマチンへの結合を直接結合することで補助していると考えられる。本研究で、HP1α とヘテロクロマチンとの結合が KAP1 の Tyr-449, Tyr-458, Tyr-517 のリン酸化によって減少することを示した (参考文献：Fig. 4)。 KAP1 は HP1α と HP1-binding-motif (PxVxL, 486-490)を介して結合していることが知られており、今回同定したチロシンリン酸化部位がは HP1-binding-motif に近くに位置している。KAP1 と HP1α の結合は Ser-473 のリン酸化によっても制御されていることが知られているため (Chnag et al., 2008)、チロシンリン酸化されることでセリンのリン酸化が誘導されるのではないかと考えられたが、DNA 損傷応答がないときにはセリンのリン酸化には影響を与えなかった (参考文献：Fig. 4G)。そのため、HP1α との結合の減少はチロシンリン酸化自体によるものだと推測される。 HP1α とチロシンリン酸化との関係については、Jak2 がヒストンの Tyr-41 を直接チロシンリン酸化することで、クロマチンとの結合が減少することが知られているが (Dawson et al., 2009)、我々は今回その 7 モデルとは異なる KAP1 のチロシンリン酸化を介したモデルを提示することが出来た。今回、KAP1 のチロシンリン酸化による機能変化については、すでに分化した細胞においてそのメカニズム解析を行なったが、KAP1 は転写の抑制やヘテロクロマチンの構成を通して、分化において非常に重要な役割を持つことが知られている。KAP1 のノックアウトは胎生致死になることや、卵母細胞が胚へと分化していく過程でも必要なことが知られている (Cammas et al., 2000; Messerschmidt et al., 2012)。KAP1 による転写制御には HP1 との結合が寄与していることが知られていることから(Cammas et al., 2004)、今回見つけたチロシンリン酸化が細胞の分化過程において転写の制御に関わっていることも考える。KAP1-3YF のノックインマウスを作製することができれば、個体発生の分化過程における KAP1 のチロシンリン酸化の意義を調べることができると考えている。私は KAP1 のチロシンリン酸化部位を同定し、チロシンリン酸化によって KAP1 とヘテロクロマチンタンパク質との結合が減少することを見出した。本研究では特に KAP1 のチロシンリン酸化にのみターゲットを絞ったが、他にも核内チロシンキナーゼの基質候補と考えられるタンパク質は他にも同定されている。さらなる研究によって、核内チロシンリン酸化シグナルとクロマチン構造の制御メカニズムへの理解が進めていきたいと考えている。 8 Materials and Methods プラスミド, RT-PCR 参考文献の EXPERIMENTAL PROCEDURES を参照抗体以下のような抗体を用いた： phosphotyrosine (pTyr) (4G10 and polyclonal antibody; Upstate Biotechnology, Inc; provided by T. Tamura and T. Yoshimoto [Tamura et al., 2000]), Lyn (Lyn9; Wako Pure Chemical Industries, Osaka, and Lyn44; Santa Cruz Biotechnology), Flag (M2 and polyclonal antibody; Sigma), HA (Y11; Santa Cruz Biotechnology), actin (clone C4; CHEMICON International), α-tubulin (MCA78G; Serotec), Src phosphorylated on Y416 (Cell Signaling Technology), KAP1 (ab10484; Abcam, and Bethyl Laboratories), HP1α (05-689; Millipore), histone H3 trimethylated on lysine 9 (H3K9me3) (ab8898; Abcam), Syk (4D10; Santa Cruz Biotechnology), Brk (C-18; Santa Cruz Biotechnology), Abl (8E9; BD-Pharmingen), Fyn (Fyn3; Santa Cruz Biotechnology), Src (GD11; Upstate Biotechnology, Inc), Ku70 (C-19; Santa Cruz Biotechnology), ErbB4 (C-18; Santa Cruz Biotechnology), Chk2 (DCS-273; Medical and Biological Laboratories), Chk2-pT68 (Cell Signaling Technology), KAP1-pS473 (BioLegend), KAP1-pS824 (Bethyl Laboratories), lamin A/C (N-18; Santa Cruz Biotechnology) ホースラディッシュペルオキシダーゼ - フラグメント (HRP)-F(ab’)2 をウェスタンブロッティングの二次抗体として使用した(Amersham Biosciences)。FITC-IgG, TRITC-IgG, and Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 546-, および Alexa Fluor 647-labeled IgG (invitrogen) を染色の二次抗体として使用した。細胞とトランスフェクション COS-1 細胞と HeLa S3 細胞 (Japanese Collection of Research Bioresources, Osaka) は 5% bovine serum (BS) を含む Iscove's modiﬁed Dulbecco's medium (IMDM) で細胞培養した。一過性のトランスフェクションは直鎖状の polyethylenimine (25 kDa; Polysciences) [Fukumoto et al., 2010]または Lipofectamine 2000 (Invitrogen) を使用して行なった。NLS-Lyn の安定発現細胞はレトロウィルスを用いた方法にて作製した（Nakatani et al., 2003）。DNA 損傷応答はアドリアマイシン (ADR) を 100 ng/ml で一時間処理し、誘導した。SFK の阻害剤として SU6656 を 5-10 µM または PP2 を 10 µM で処理した。ウェスタンブロッティングライセートは SDS- サンプルバッファーに溶解して作成し、 SDS-PAGE で分離し、 polyvinylide-nediﬂuoride (PVDF) メンブレン(Millipore) にトランスファーした。検出方法は過去の報告に従った (Kasahara et al., 2004; Matsuda et al., 2006; Kuga et al., 2008)。多くの抗体を用いて検出するため、一次抗体、二次抗体それぞれを除去し、次のブロットを行った。一次抗体はストリッピングバッファーを 9 用い、二次抗体は HRP の不活化を 0.1% NaN3 を用いて行った。結果は、イメージアナライザーである LAS-1000plus (Fujiﬁlm, Tokyo, Japan) と ChemiDoc XRSplus (Bio-Rad) を用いて解析した。化学発光のインテンシティー測定は Quantity One software (Bio-Rad) を用いた。免疫沈降法細胞を Tirton X-100 lysis buffer (30 mM HEPES (pH7.4), 100 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 4 mM EDTA, 10 mM NaF, 50 µg/ml aprotinin, 100 µM leupeptin, 25 µM pepstatin A, and 2 mM PMSF) にて suspend し、 sonication を用いて溶解した。protein G beads に適切な抗体を付加したもので免疫沈降を行なった。細胞分画細胞をPBSでwashしてから200 gで遠心する。細胞のペレットを Low salt buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 0.34 M sucrose, 10% glycerol, 1.7 mM MgCl2, 10 mM NaF, 4 mM β-glycerophosphate, 2 mM Na3VO4, 50 µg/ml aprotinin, 100 µM leupeptin, 25 µM pepstatin A, and 2 mM PMSF) でサスペンドし、氷上で 10 min インキュベーションした。その後、遠心分離を 2,000 g で 5 min 行ない、上清を Low salt 画分とする。遠心分離にて落ちてきたペレットを High salt buffer (50 mM HEPES, pH 7.4, 300 mM KCl, 1.0% Triton X-100, 20% glycerol, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 10 mM Na3VO4, 1 mM EDTA, 50 µg/ml aprotinin, 100 µM leupeptin, 25 µM pepstatin A, and 2 mM PMSF)でサスペンドし、氷上で 20 min インキュベーションする。その後、遠心分離を 17,900 g で 10 min 行ない、上清を High salt 画分とする。残ったペレットを High salt buffer でもう一度 wash した後、SDS sample buffer と sonication にて溶解し Insoluble 画分とした (Mendez et al., 2000; Goodarzi et al., 2008; Herkret et al., 2010)。免疫蛍光顕微鏡観察免疫蛍光染色は過去に報告した方法に従った (Nakayama and Yamaguchi, 2005; Nakayama et al., 2012)。クロマチンに結合している KAP1 と HP1α の染色は、細胞を High salt buffer にて氷上で 3 min 抽出した後、100% MeOH にて-20℃で 5 min 固定した。細胞固定後、0.1%サポニン 3% bovine serum albumin で抽出及びブロッキングを行い、一次抗体、二次抗体をそれぞれ 1 時間インキュベーションした。 DNA 染色は、200 µg/ml RNaseA を 30 分間処理した後、20–50 µg/ml propidium iodide (PI) , 20 nM TO-PRO-3 (Molecular Probes), 0.1 µg /ml 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlo-ride (DAPI, Sigma)で行なった。共焦点、ノマルスキー微分干渉イメージは Fv500 レーザースキャン顕微鏡を使って画像取得した。40×1.00 ドライレンズと 60×1.00 水浸レンズ (Olympus)を使用した。 10 References Amanchy, R., Zhong, J., Hong, R., Kim, J. 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Sho Kubota, Yasunori Fukumoto, Kazumasa Aoyama, Kenichi Ishibashi, Ryuzaburo Yuki, Takao Morinaga, Takuya Honda, Noritaka Yamaguchi, Takahisa Kuga, Takeshi Tomonaga, and Naoto Yamaguchi: Phosphorylation of KRAB-associated protein 1 (KAP1) at Tyr-449, Tyr-458, and Tyr-517 by nuclear tyrosine kinases inhibits the association of KAP1 and heterochromatin protein 1α (HP1α) with heterochromatin. J. Biol. Chem., 288: 17871-17883, 2013. 2. Kazumasa Aoyama, Ryuzaburo Yuki, Yasuyoshi Horiike, Sho Kubota, Noritaka Yamaguchi, Mariko Morii, Kenichi Ishibashi, Yuji Nakayama, Takahisa Kuga, Yuuki Hashimoto, Takeshi Tomonaga and Naoto Yamaguchi: Formation of long and winding nuclear F-actin bundles by nuclear c-Abl tyrosine kinase. Exp. Cell Res., 319: 3251-3268, 2013. 3. Kenichi Ishibashi, Yasunori Fukumoto, Hitomi Hasegawa, Kohei Abe, Shoichi Kubota, Kazumasa Aoyama, Sho Kubota, Yuji Nakayama, and Naoto Yamaguchi: Nuclear ErbB4 signaling through H3K9me3 is antagonized by EGFR-activated c-Src. J. Cell Sci., 126:625-637, 2013. 4. Kazumasa Aoyama, Yasunori Fukumoto, Kenichi Ishibashi, Sho Kubota, Takao Morinaga, Yasuyoshi Horiike, Ryuzaburo Yuki, Akinori Takahashi, Yuji Nakayama, and Naoto Yamaguchi: Nuclear c-Abl-mediated tyrosine phosphorylation induces chromatin structural changes through histone modifications that include H4K16 hypoacetylation. Exp. Cell Res., 317: 2874-2903, 2011. Examiners 本学位論文の審査は千葉大学大学院薬学研究院で指名された下記の審査委員により行われた。主査千葉大学大学院教授（薬学研究院）薬学博士村山俊彦副査千葉大学大学院教授（医学研究院）医学博士岩間厚志副査千葉大学大学院教授（薬学研究院）薬学博士伊藤素行 17 Acknowledgements 本研究に際し、御指導、御鞭撻を賜りました指導教官の千葉大学大学院薬学研究院山口直人教授に厚く御礼申し上げます。また、多くの御助言を賜りました准教授中山祐治博士 (現京都薬科大学教授)、講師福本泰典博士、助教山口憲孝博士に心から御礼申し上げます。山口教授をはじめとした諸先生方のご指導のおかげで、本研究を論文へと完成することが出来ました。本学位論文の審査をして下さった教授村山俊彦博士、教授岩間厚志博士、教授伊藤素行博士に心から御礼申し上げます。研究を進めるに際して、様々なアドバイスをして下さり、ともに励まし合いながら研究をここまで一緒に進めてくれた諸先輩方や同輩、後輩の皆様方に深く感謝申し上げます。皆様と同じラボで６年間の研究生活を送ることが出来たことを非常に感謝しております。貴重な研究試料を提供してくださった、Dr. Hiroyoshi Ariga (Hokkaido University), Dr. Donald J. Fujita (University of Calgary), Dr. Tadashi Yamamoto (University of Tokyo), Dr. Eli Canaani (Weizmann Institute of Science), Dr. Toshiki Tamura (National Institute of Infectious Diseases), Dr. Takayuki Yoshimoto (Tokyo Medical University), Dr. Edward A. Clark (University of Washington), Atsushi Iwama (Chiba University), Dr. Shigeyuki Yokoyama (RIKEN), and Dr. Hiroyuki Miyoshi (RIKEN BRC)、諸先生方のご協力に御礼申し上げます。 18