CTL antiviraux : from bench to bedside

CTL antiviraux :
From Bench to Bedside
Le 21 Novembre 2014
Pr Danièle BENSOUSSAN
Unité de Thérapie Cellulaire et banque de Tissus (UTCT), CHU de Nancy
UMR-CNRS 7365 et FR CNRS-INSERM-UL-CHU 3209
1
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Résultats cliniques préliminaires
Virologie
Traitement IS +/- Déplétion
de lymphocyte T (in vivo)
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Allogreffe de CSH
Déplétion de lymphocytes T
dans le greffon (ex vivo)
Receveur
Donneur
Conditionnement
Non prise ou
rejet de la greffe
Effet Graft vs Leukemia
(GvL)
Reconstitution hématopoïétique
et immunitaire
Graft vs Host Disease
(GvHD)
Lenteur de la
Reconstitution Immunitaire
Donneur HLA
compatible
Immunodéficience
EBV
CMV
Complications
(Infections virales)
ADV
2
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
55 sérotypes répartis en 7 espèces (A à G)
85% de la population mondiale infectée
A
D
V
Réponse cellulaire:
Protéine immuno-dominante (Protéine HEXON)
Lymphocytes T CD4 et CD8
Jones et al., 2007 ; Walsh et al., 2009
Pathologies post-greffe :
Diarrhées, cystites, pneumonies et hépatites,
Méningo-encéphalites
L’incidence de l’infection ADV après HSCT : 5-47%
Traitements:
Anti-viraux : ganciclovir, vidarabine, ribavirine et cidofovir
Immunothérapie cellulaire : CTL-ADV
3
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Protéines d’enveloppe
(gB, gN)
Enveloppe
lipidique
E
B
V
Tégument
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Agent de la mononucléose infectieuse
95% de la population mondiale infectée
Infecte préférentiellement les LB
Réponse cellulaire:
ADN viral
Nucléocapside
Protéines immunodominantes :
nombreuses protéines lytiques et de latence
Lymphocytes T CD8 et CD4
Nicolas et Meyohas, 2003
Pathologies post-greffe : Syndrome lymphoprolifératif (PTLD)
L’incidence de PTLD : 0,2% - 8,1% selon le nombre de facteurs de risques :
Immunodépression du receveur, incompatibilité HLA, âge du receveur et dose de CD34
Traitements:
Anti-viraux : ganciclovir et acyclovir (inefficace)
Chimiothérapies
Anticorps Monoclonal anti-CD20 : Rituximab (30% d’échec)
Immunothérapie cellulaire : CTL-EBV
(Hislop et al., 2007)
4
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
50% de la population Adulte européenne séro+
(100% de la population asiatique)
Infecte préférentiellement les Monocytes
C
M
V
Réponse cellulaire:
Protéines immunodominantes : pp65 et IE1
Lymphocytes T CD8 et CD4
Pathologies post-greffe : Pneumopathie CMV, maladie CMV gastro-intestinale,
Hépatite, rétinite ou encéphalite (rare).
Traitements:
Anti-viraux : ganciclovir, foscarnet, valgancyclovir
D’autant plus efficace que mis en place de façon pré-emptive
5
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Résultats cliniques préliminaires
Virologie
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Importance de reconstitution immunitaire cellulaire spécifique
Phase tardive
J100
J45
J360
Nombres
des LT
matures
CSH du donneur
x
J100 Temps après l’allogreffe
de CSH (Jours)
x
Donneur de CSH
LT matures
du donneur
LT
Phase de la prise
de greffon
LB
Phase précédant la
prise de greffon
Nombres
des LT
matures
GvHD, IS+
J100
Temps après l’allogreffe
de CSH (Jours)
Restauration de l’Immunité cellulaire par injection de CTL
CTL
Phénotypique: Expression des marqueurs d’activation :
CD25, CD137, CD154
Fonctionnel: Cytokines (IFN-g), granzyme et perforine
Prolifération après stimulation antigénique
6
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Donor
Viral Antigen
DLI
Allo-depletion
Antigen Presenting Cell
(APC)
Anti-virus cytotoxic T
Lymphocytes
Anti-Leukemic T
Lymphocytes
Antivirus
CTL
Alloreactive T Lymphocytes
Recipient
7
Contexte
Allogreffe
Donor Lymphocyte Infusion
ADV
Résultats Pré-cliniques
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Donor
Viral Antigen
DLI
Allo-depletion
Antigen Presenting Cell
(APC)
Anti-virus cytotoxic T
Lymphocytes
Anti-Leukemic T
Lymphocytes
Antivirus
CTL
Alloreactive T Lymphocytes
Recipient
9
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Méthodes d’isolement
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Donneur
Culture
Sélection Immunomagnétique
CD
IFN γ
25/137/154
Multimères
IFN g
24 à 48 heures
15 jours - 1 mois
Résultats cliniques préliminaires
Réalisation de banque CTL
Receveur
(Wang et al., Virologie, 2012) 10
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Méthodes par culture cellulaire
15 jours - 1 mois
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Donneur
Culture
Réalisation de banque CTL
Receveur
(Wang et al., Virologie, 2012) 11
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Méthodes de production par culture cellulaire
irradiation
Donneur
Heslop et al, 1995
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Protocole
d’expansion
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Cellules
injectées
Patients traités
Résultats cliniques
Références
In vitro
CTL polyclonal
10 (3 comme traitement
et 7 comme prophylaxie)
3/3 ont contrôlé l’infection
Rooney et al.,
1995 ; Heslop et al.,
1996
In vitro
CTL polyclonal
39 avec traitement
prophylactique
Aucun patient n’a développé de PTLD en
comparaison avec 11,5% du groupe contrôle
Rooney et al., 1998
In vitro
CTL polyclonal
6 patients traités
5 patients en rémission complète ; 1 décédé
Rooney et al.,
1998 ; Gottschalk et
al., 2001
In vitro
CTL polyclonal
114 patients (101 ont reçu un
traitement prophylactique ; 13
ont reçu un traitement curatif)
101/101 : aucun développement d’un EBV-PTLD
11/13 : rémission complète
Heslop et al., 2010
In vitro
CTL polyclonal
6 avec une forte charge virale
5/6 ont réduit la charge virale post-CTL.
1/6 décédé suite à un PTLD
Gustafsson et al.,
2000
In vitro
CTL polyclonal
1 patient traité pour une
lymphoprolifération induite par
l’EBV
Pas de réponse à la thérapie
Imashuku et al.,
1997
In vitro
CTL polyclonal
6 patients (dont 5 ayant
développé un PTLD) ont été
traités par CTL anti-EBV (2
n’ont pas répondu au
Rituximab ; 4 ont vu leur
charge virale EBV
réaugmenter à l’arrêt du
traitement)
Une négativation de la charge virale EBV, une
résolution clinique des PTLD chez tous les
patients. Aucun évènement indésirable, ni aucune
réaction de GvH.
Comoli et al., 2002 ;
2007 ; 2008
In vitro
Partly-matched
polyclonal CTL
8 patients avec un PTLD
progressif ne répondant pas
aux traitements conventionnels
ont été traités.
3 patients ont une réponse complète ; 2 patients
sans réponse ; 3 patients n’ont pas fini le traitement
Haque et al., 2002
In vitro
Partly-matched
polyclonal CTL
33 patients avec un PTLD ne
répondant pas aux traitements
conventionnels ont été inscrits.
14 patients ont une réponse complète ; 3 avec
réponse partielle ; 16 sans réponse
Haque et al., 2007
Contexte
Allogreffe
Résultats Pré-cliniques
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Méthodes de production par culture cellulaire : Inconvénients
- Temps de culture et d’expansion très longs
- Deux mois environ sont nécessaires pour produire ces CTL
- Nécessité de les produire pour tous les patients
- Difficulté d’obtenir des cellules du donneur (surtout à partir d’un donneur
fichier)
- Essai français s’est arrêté avec l’avènement du Rituximab
- Coût de production (à comparer au coût du Rituximab)
- Développement de banques de CTL anti-EBV HLA
partiellement compatibles
- Haque et al, 2002; Haque et al, 2007; Vickers et al, 2014; Vié et al, 2014
- Choix des CTL anti-EBV les plus compatibles avec le receveur : (forte
cytotoxicité contre EBV-LCL donneur et faible contre blastes PHA receveur)
- 33 patients EBV-SLP traités
- Aucune GVHD n’est survenue.
- Réponse (complète ou partielle) : 64% à 5 semaines et 52 % à 6 mois
Contexte
Allogreffe
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
Virologie
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Méthodes de production par culture cellulaire : Evolutions
Gerdemann et al., 2009, 2011, 2013
Etude clinique (Gerdemann, 2013):
10 patients traités par des CTL multi-virus
7/10 en rémission complète, dont 4 sans traitement anti-viraux
associés.
15
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Méthodes des Multimères
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Donneur
Culture
Sélection Immunomagnétique
Multimères
24 à 48 heures
15 jours - 1 mois
Résultats cliniques préliminaires
Réalisation de banque CTL
Receveur
(Wang et al., Virologie, 2012) 16
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Méthodes des Multimères
Chaine lourde Cl I
b2 microglobuline
Streptavidine PE
Biotine
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Contexte
Allogreffe
Méthodes des Multimères
Résultats Pré-cliniques
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Résultats cliniques préliminaires
Virologie
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Essais cliniques de Phase I/II par technique des multimères
19 patients : 14 RC, 3 RP, 2 NR
CTL-ADV
CTL-EBV
CTL-CMV
1 étude (1 patient)
1 étude (1 patient)
3 études (17 patients)
ADV : infection
Charge virale : 1,6x105 cp/ml
EBV : PTLD
Infection 12 mois plus tard
CMV : infection
CTL haploidentique (Mère)
1ère dose : 3,1 x104 /kg
2ème dose : 1,7 x104 /kg
CTL :
1ère dose : 1,4 x104/kg
2ème dose : 2 x104/kg (12 mois)
CTL :
0,8 - 24,6x104/kg
CTL détéctés transitoirement
RC : résolution de PTLD
avec présence de CTL
RC : négativation de charge virale
RC : 13/17
avec présence de CTL
RP : 3/17
NR : 1/17
Echec
Uhlin et al., 2012
Uhlin et al., 2010
Cobbold et al., 2005; Schmitt et al., 2011;
Uhlin et al., 2010
Absence d’effets indésirables
Efficacité dans les infections à CMV
EBV?
ADV : fréquence de CTL trop faible?
19
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Méthode basée sur sécrétion d’IFNg
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Donneur
Culture
Sélection Immunomagnétique
CD
IFN γ
25/137/154
Multimères
IFN g
24 à 48 heures
15 jours - 1 mois
Résultats cliniques préliminaires
Réalisation de banque CTL
Receveur
(Wang et al., Virologie, 2012) 20
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Résultats cliniques préliminaires
Virologie
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Essais cliniques I/II par technique basée sur la sécretion d’IFN-g
74 patients : 65 en curatif dont 60 évaluables : 48 RC ou RP, 12 NR
CTL-ADV
CTL-EBV
CTL-CMV
3 études (15 patients)
2 études (16 patients)
3 études (43 patients)
ADV : Infection ou maladie
EBV : Infection ou PTLD
CMV : Infection ou maladie ou
prophylaxie (9)
CTL : 1,2 -50 x104 /kg
CTL : 0,015-970 x104/kg
CTL : 0,12-16,6 x104 /kg
1/15 aggravation de GvHDc
pas de GvHD de novo
3 GvHD de novo (Peggs)
RC : 8/15 , avec présence de CTL
RP : 1/15
NR : 3/15
Non évaluables : 3/15
RC : 9/16, avec présence de CTL
RP : 2/16
NR : 5/16
RC ou RP : 28/34
NR : 4/34
Prophylaxie : 9/9 avec presence de
CTL
Non évaluables : 2/34
Feuchtinger et al., 2006; Quasim et al.,
2013; Di nardo et al., 2013
Moosmann et al., 2010; Icheva et al.,
2012;
Mackinnon et al., 2007; Feuchtinger et
al., 2010; Peggs et al., 2011
Peu d’effets indésirables,
Efficacité curative vis-à-vis des Infections ADV, EBV et CMV (> 50%)
Efficacité prophylactique vis-à-vis du CMV (100%)
21
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Résultats cliniques préliminaires
Virologie
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Essais cliniques I/II : Feuchtinger et al, 2006
c
c
c
c
c
Contexte
Allogreffe
Résultats Pré-cliniques
Virologie
Essais cliniques I/II : Feuchtinger et al, 2006
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Allogreffe
Virologie
Résultats cliniques préliminaires
Immunothérapie cellulaire (CTL)
Essais cliniques de phase I/II avec CTL multivirus par culture cellulaire
CTL-Bivirus
ADV/EBV
CTL-Trivirus
(ADV/EBV/CMV)
1 étude (12 patients)
Prophylaxie
EBV : 10/12 présence de CTL
ADV : 2/12 présence de CTL
(infection ou maladie ADV)
Aucune infection ADV de novo
2 études (21 patients)
1 étude (11 patients)
Prophylaxie (10/21)
Prophylaxie (3/11)
EBV : 3, CMV : 3, ADV : 5
réactivations post- CTL : RC
spontanée, présence de CTL
Pas de GvHD de novo
Curatif (11/21):
3 CMV, 2 ADV, 2 EBV,
2 ADV/EBV, 2 ADV/CMV
RC : 8/11
NR: 3 évolutions
1 GVHDc grade II
Leen et al., 2009
CTL-multivirus
(ADV/EBV/CMV/BKV/HHV6)
Leen et al., 2006; Gerdemann et al., 2013
Pas de réactivation virale
Pas de GvHD de novo
Curatif (8/11)
RC : 7/8 présence de CTL
NR : 1/8
Pas de GVHD de novo
Papadopoulou et al., 2014
Technique IFN-g pour isoler les CTL multivirus :
uniquement au stade pré-clinique
24
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
CTL-ADV
CTL-EBV
Antigène de stimulation
Antigène de stimulation
Production de CTL-ADV
Production de CTL-EBV
Contrôles qualité in vitro
Contrôles qualité in vitro
J. Immunother. 2010 May; 33 (4) : 414-424
25
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Choix de l’antigène de stimulation
ADV
Antigène Immunogène :
Protéine Hexon
EBV
Antigènes Immunogènes :
Protéines de Latence : EBNA 3A,
3B, 3C, LMP2, EBNA1
Protéines cycle Lytique : BZLF1,
etc..
Antigène UTCT :
Peptivator ADV5 Hexon GMP
(Miltenyi Biotec)
15 aa
11 aa
……
Antigène UTCT :
- Peptivator EBNA-1 GMP
- Peptivator BZLF-1 GMP
(Miltenyi Biotec),
- pool de 15 peptides d’EBNA 3A,
3B, 3C (PepMix, JPT)
Futur:
- Peptivator EBV consensus GMP
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Choix de l’antigène de stimulation
EBV
ADV
Temps d’incubation : 6 heures
Temps d’incubation : 9 heures
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Choix de l’antigène de stimulation
PepTivator® EBV Consensus (Miltenyi biotec) :
43 Peptides issus de 11 protéines incluant LMP2a, BRLF1, BMLF, BNLF1, EBNA3C,
EBNA3A, EBNA3B, BALF2, BMRF1, BZLF1, BNRF, EBNA1, BLLF1)
Comparaison de la réponse IFN-g des PBMC à deux antigènes EBV
1600
1400
SFC/106 PBMC
1200
1000
800
600
400
200
0
Pool Peptide EBV UTCT
PepTivator® EBV Consensus
Ag de stimulation GMP
28
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Génération de CTL-EBV par technique immunomagnétique
4
3
Incubation 6/9h
5
Marquage
2
Séparation
des CMNs
Sang du donneur avec
RI anti-virale +
Stimulation par antigène
défini (EBV)
Analyse phénotypique par CMF
1
7
Culture
cellulaire
7
6
Sélection des donneurs
présentant réponse +
préalablement par Elispot
Isolement par Midi MACS
29
CD4
After selection
ADV
N°
TNC (106)
Enrichment
CD4-IFNg+
(%)
CD4-IFNg+
(%)
Enrichment
CD8-IFNg+
(%)
CD8-IFNg+
(%)
Viability
(%)
Mean
1.01
56
51
42
56
76
SD
0.84
20.8
32.4
Range
[0.38 – 2.5]
[15.7 –79.7]
[11.7 – 100]
[15.4 – 85]
[1.91 – 100]
[58 – 91.6]
0,53
24,7
21,2
51,4
48,3
59
0.25
18,0
34,4
[0.24 – 0,93]
[10.3 –49.0]
[5,9 – 89]
[7 – 84]
[16,4 – 100]
[41 – 74]
Mean
EBV
Yield
Yield
SD
Range
CD8
After selection
N°
Mean
ADV
EBV
TNC
(106)
1.01
Enrichment
CD4-IFNg+
(%)
CD4-IFNg+
(%)
Enrichment
CD8-IFNg+
(%)
CD8-IFNg+
(%)
56
51
42
56
76
27
39.3
13.1
Yield
SD
Yield
Viability
(%)
Range
[0.38 – 2.5]
[15.7 –79.7]
[11.7 – 100]
[15.4 – 85]
[1.91 – 100]
[58 – 91.6]
Mean
0,53
24,7
21,2
51,4
48,3
59
SD
0.25
27
34
12
Range
[0.24 – 0,93]
[7 – 84]
[16,4 – 100]
[41 – 74]
[10.3 –49.0]
[5,9 – 89]
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Peptivator EBV Consensus / pool peptides EBV UTCT
Pool de peptides EBV UTCT
PepTivator® EBV Consensus
CD4
15,37%
9,4%
CD8
54,99%
51,99%
IFNg
Enrichement similaire entre les deux antigènes EBV de stimulation
32
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Contrôles fonctionnels : expansion
- 2 semaines de culture : 100 IU/ml IL-2
feeder cells autologues
ADV
EBV
EBV
Expansion moyenne : 1.7 Log
Expansion myenne : 1,88 Log
(85 106 CNT après 2 semaines)
(100 106 CNT après 2 semaines)
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Contrôles fonctionnels : Cytokines intra-cellulaires après restimulation
ADV
EBV
Avant expansion
Pureté moyenne : CD4-IFNg : 43.2 +/- 23.5%
CD8-IFNg : 35.4 +/- 23.8%
Après expansion
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Contrôles fonctionnels : Prolifération après restimulation
4 jours avec différents antigènes (H3 thymidine 18h) cpm: counts per minute
ADV
EBV
ADV
EBV
Before selection
Median
EBV
Peptivator-
Range
After selection
Median
Range
EBV
ADV5
Hexon (cpm)
766
[4191113]
22180
[274560678]
PHA (cpm)
195522
[85687234818]
3860
[240714165]
Prolifération :
- vis-à-vis de l’Ag de stimulation
Prolifération :
- vis-à-vis de l’Ag de stimulation et de ses composants
Pas de prolifération vis-à-vis de l’Ag non relevant
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Contrôles fonctionnels : Cytotoxicité
ADV
EBV
58%
53%
20%
20%
2,8%
41,7%
39,5%
18,3%
2,4%
EBV
Cytotoxicité moyenne :
- 20% contre cibles infectées avec lysats ADV2/5,
- 53% contre cibles chargées avec PepT-ADV5 Hexon
- 2,8% contre cibles non chargées
- 2,4% contre cibles chargées avec PepT-CMV pp65
0,5%
EBV
Cytotoxicité moyenne :
- 58% contre cibles chargées avec Ag stimulation,
- 18,3% contre EBV-LCL autologue
- 0% contre cibles non chargées
- 0,5% contre cibles chargées avec PepT-CMV pp65
Contexte
Résultats Pré-cliniques
Résultats cliniques préliminaires
CTL anti-ADV et anti-EBV
Contrôles fonctionnels : Alloréactivité (Culture Mixte Lymphocytaire
CTL et CMN avant sélection mis en en culture avec des CMN irradiées de tierce partie
ADV
EBV
80000
Proliferation (cpm)
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Before selection
ADV-specific T cells
Réduction moyenne de 1.27 Log de l’alloréactivité des
CTL anti-ADV contre donneurs tierce partie comparée à
l’alloréactivité des PBMC avant sélection.
Réduction moyenne de 94.7 ± 3.3% (~ 1 Log ) de
l’alloréactivité des CTL anti-ADV contre donneurs
tierce partie comparée à l’alloréactivité des PBMC
avant sélection.

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