06-maldi

MALDI
Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
Matrice cristallina (anziché liquida).
Fascio di fotoni (anziché di atomi).
Adatto per composti simili a quelli analizzabili con FAB, ma a più
alta sensibilità (100-1000 volte meglio) e con molti meno limiti
nelle dimensioni dell’analita: pesi molecolari fino a 3-400 kDa.
Gli ioni prodotti sono generalmente “a singola carica”.
L’analizzatore è solitamente “TOF” (time of flight).
IONIZZAZIONE MALDI
In condizioni di “alto vuoto” impulsi laser
colpiscono la sonda su cui sono cocristallizzati matrice e campione.
L’energia del laser viene trasferita in un
lasso di tempo estremamente breve (pochi
ns)
non si ha decomposizione
termica delle molecole.
Le molecole di matrice assorbono la maggior
parte dell’energia del laser limitando:
DECOMPOSIZIONE/DANNEGGIAMENTO
DEL CAMPIONE e/o FRAMMENTAZIONE
DEGLI IONI.
Il flusso laser viene controllato attraverso un sistema di attenuazione del raggio
al fine di evitare:
INCREMENTO DEL RUMORE DI FONDO e SATURAZIONE DEL DETECTOR.
Gli ioni prodotti vengono accelerati dalla superficie dei cristalli (nella
sorgente) all’analizzatore mediante applicazione di una differenza di
potenziale.
Detector
Griglia di
estrazione
+
Laser
Matrice
Assorbe l’energia della
luce laser e
“la trasmette al campione”
+
+
+
+
-
+
Campione ionizzato
+
Bersaglio
Campione
+
matrice
PROPRIETÀ DELLA MATRICE
9Deve essere attivata con una certa lunghezza d’onda
laser (in genere 330nm).
9Deve avere caratteristiche di solubilità simili a quelle
dell’analita.
9Deve avere un protone disponibile da donare durante
la ionizzazione.
9Dovrebbe avere un’affinità per il protone minore di
quella dell’analita.
9Dovrebbe essere chimicamente inerte nei confronti
dell’analita.
9Normalmente ha natura di solido cristallino.
PRINCIPALI FUNZIONI DELLA MATRICE
9 Assorbire la maggior parte dell’energia del laser proteggendo
le molecole di analita dalla foto-dissociazione.
9 Isolare spazialmente le molecole dell’analita evitando la
formazione di possibili aggregati.
9 Dare origine a reazioni fotochimiche che garantiscano la
ionizzazione del campione.
Struttura di alcune matrici:
MATRICE
Acido sinapinico
DHB (Ac. 2,5-Diidrossibenzoico)
Super-DHB
α-ciano (Ac. α-ciano-4-idrossi cinnamico)
HABA (Ac. 2’-(4-idrossifenilazo)benzoico)
THAP (1) (2,4,6-triidrossiacetofenone)
HPA (1) (Ac. 3-idrossipicolinico)
Ditranolo (2)
IAA (2)
Additivi
1.
2.
Citrato d’ammonio
Ag-TFA
ANALITA
Proteine/glicoproteine/polimeri polari
Proteine/glicoproteine/zuccheri/polimeri polari
Proteine/glicoproteine/zuccheri/polimeri polari
Peptidi
Peptidi/proteine
Oligonucleotidi
Oligonucleotidi
Polimeri non polari
Polimeri non polari
Dried droplet
Preparazione del campione
• Viene preparata una soluzione satura di matrice; generalmente in una soluzione
(0,1% TFA : CH3CN) (2:1)
• La soluzione dell’analita è preparata (preferibilmente nello stesso solvente) ad una
concentrazione di ~ 5-10 pmol/µl
• Matrice e analita vengono miscelati in rapporto molare da 100:1 a 50000:1
• 0,3-2 µl di miscela finale sono deposti sul target e fatti essiccare
Thin layer
Simile al dried droplet, ma matrice e analita non sono pre-miscelati.
• Un piccolo volume di matrice solubilizzata in un solvente organico quale
acetone o etanolo viene deposta sul target (l’essiccamento è rapido).
• Il campione viene deposto sopra alla matrice essiccata.
Double thin layer
• Il campione miscelato alla matrice viene deposto su uno strato di matrice
essiccata
Suggested MALDI preparation
The sample should NOT contain any:
•
•
•
•
•
•
•
•
AzideSDS
Brij 35 Tris base
CHAPS Triton X-100, Treduced Triton X-100
DMSO Tween
DMF Zwittergent
Glycerol any other detergent **
Phosphate buffers
Salts and buffers >100 mM **
The following components are ACCEPTABLE:
•
•
•
•
•
Acetic or formic acid
Guanidine/HCl 4M
Hexafluoroisopropanol up to 40%
Sodium chloride 10 mM
Urea 1M
** Common Problem
MALDI - Produzione degli ioni
Il meccanismo esatto non è stato ancora completamente chiarito.
Si presume sia dovuto alla conversione dell’energia elettronica
assorbita
dalle
molecole
di
matrice
in
energia
rotazionale,
traslazionale e oscillatoria, che determina la distruzione dei cristalli
matrice/analita e il loro “dissolvimento esplosivo”
VAPORIZZAZIONE DELLE MOLECOLE DI CAMPIONE
Probabilmente nel passaggio delle molecole di campione alla fase
gassosa, esse “si caricano”.
PROBABILE MECCANISMO DI FORMAZIONE DEGLI IONI
ESPT: Excited-state proton transfer
M + hν
– matrix-matrix reactions:
M* + M
(M - H)- + MH
– matrix ion - neutral analyte reactions:
M* + A
M*
(M - H)- + AH
+
+
Proton transfer continued:
– deprotonation:
(M - H ) - + A
M + (A - H)-
• not predicted to occur due to low gas phase basicity of matrix anions
compared to typical analytes
• could occur by electron capture:
A + e(A - H)- + H•
ANALIZZATORE TOF (Time of Flight)
Una volta prodotte, le molecole ionizzate vengono accelerate in un campo
elettrico.
L’energia cinetica che ogni ione acquisisce è funzione del rapporto
massa/carica (m/z).
Gli ioni accelerati entrano nel tubo
di volo con differente velocità e
raggiungono il rivelatore in tempi
differenti, dando segnali distinti
(le prime ad arrivare saranno le
specie con il rapporto m/z più
basso) .
Durante
“il
volo”
le
molecole
cariche di analita verranno anche
separate da quelle di matrice.
MODALITA’ DI ANALISI
(MALDI)
•Linear (positive/negative)
-minor risoluzione di massa, ma maggiore sensibilità
•Reflectron (positive/negative)
-maggior risoluzione, minor sensibilità
•Delayed Extraction
-offre una migliore risoluzione, specialmente ai più alti pesi
molecolari
Continuous Extraction
Delayed Extraction
MALDI-TOF
Sorgente
Bersaglio
Detector
Reflectron
Reflectron
Detector lineare
REFLECTRON:
Serie di anelli con potenziale crescente
agiscono da specchi elettrostatici
Gli ioni con uguale massa (anche con leggera differenza di energia)
vengono rallentati, riflessi e nuovamente accelerati dal reflectron.
Spettrometri di massa TOF
LINEAR
REFLECTING
Fattori che influenzano la qualità
dell’analisi MALDI:
* Grandezza dei cristalli
* Energia del laser
* Voltaggio del detector
* Voltaggio di accelerazione
* Tempo di estrazione
* Numero di impulsi laser
* Velocità di evaporazione
* Concentrazione del campione
* Rumore di fondo
* Parametri di scansione
SPETTROMETRIA DI MASSA MALDI
Intervallo di massa: 1-400000 Da
Limiti di analisi:
10-15 – 10-18 moles
Accuratezza:
0.1 – 0.01%
Sensibilità:
1 µL contenente 100 fmol – 10 pmol
Consumo di
campione:
Meno di 1 pmol
Esempi di spettro di massa MALDI:
Spettro MALDI-TOF del peptide
Angiotensina II
Si evidenzia la
“composizione isotopica”
del peptide
Spettro MALDI-TOF di un
anticorpo monoclonale
La ionizzazione MALDI può
talvolta
determinare
la
formazione di ioni multicarica
1 unita di m/z => segnali relativi ad una molecola recante una singola carica positiva
[3 13C]
..06,..
[2 13C]
..05,..
[1 13C]
..04,..
[4 13C]
(5802.64+1)/1 =5803.64 [solo 12C]
(5803.64+1)/1 =5804.64 [1 13C]
∆ picco 12C - picco 13C = 1
=> ione monocarico (1+)
[5 13C]
..08,..
(5802.64+2)/2 =2902.32 [solo 12C]
(5803.64+2)/2 =2902.82 [1 13C]
∆ picco 12C - picco 13C = 0.5
=> ione bicarico (2+)
[6 13C]
..09,..
[7 13C]
..10,..
[8 13C]
..11,..
Dalla differenza tra i picchi di massa
realativi alla distribuzione isotopica
di uno ione riesco a risalire allo stato
di carica di quel determinato ione
..12,..
..13,..
Insulina M•+
Dimero
Trimero
Insulina M•+2
Con la spettrometria MALDI, anche le forme multimeriche preesistenti in soluzione possono essere rivelate
MALDI
Vantaggi:
•
•
•
•
•
•
•
Analisi rapida e compatibile con la presenza di impurezze
Possibilità di analisi di miscele complesse
Accuratezza elevata sui bassi pesi molecolari
Richiede piccole quantità di campione
Ottiene buoni risultati con masse elevate
Fornisce misure di massa assolute
Può essere usato per analisi diretta di sequenza (PSD)
Limiti:
•
•
•
•
E’ richiesto un analizzatore di massa compatibile con tecniche di
ionizzazione a impulso (TOF)
Non compatibile con tecniche LC/MS
La scelta della matrice dipende dalle caratteristiche del campione
Gli ioni possono entrare in collisione “disperdendosi”
SELDI-ToF-MS
Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry
SELDI ProteinChip® è una tecnica di spettrometria di massa
che permette la separazione cromatografica di una proteina
sulla superficie di un chip.
Miscele complesse (es. siero) vengono deposte direttamente
sul chip in piccoli volumi e quindi sottoposte a specifici lavaggi
in modo tale da allontanare le componenti non desiderate.
Le più comuni fasi leganti sui chip per SELDI
possono essere:
• Scambio cationico
• Scambio anionico
• Affinità per metalli
• Idrofobica
• Fase inversa
• Enzimi DNA/Proteine
• Anticorpo/Antigene
• Recettore/Ligando
• ……….
Proteomics Using Ciphergen’s SELDI Technology
Surface Enhanced Laser Desorption Ionization
← Surface Chemistries
Ogni chip lega gruppi specifici
di proteine, in funzione della
fase legante presente sul
Protein chip
←Protein Chips
Es: Il siero di animali di controllo o di animali trattati
farmacologicamente viene deposto sui chip. Dopo
opportuni lavaggi e trattamenti, ogni spot viene
analizzato separatamente.
Ogni spettro di massa prodotto rappresenterà le
proteine che sono state legate sulla superficie del chip.
PROCEDURA PER ANALISI SELDI
Spettro di massa prima
della purificazione su chip
Spettro di massa dopo la
purificazione su chip
Esempi di applicazioni SELDI:
• Fingerprinting/Biomarker discovery
analisi di proteine provenienti da due diversi stati, es. campioni da
tessuto patologico rispetto a quelli da tessuto normale
• Tossicologia
analisi di biomarkers di tossicità
• Caratterizzazione di una Proteina
(Compresa identificazione di nuovi ligandi e caratteristiche della
proteina)
• Sviluppo di saggi
(semplificazione o sviluppo di metodologie esistenti)
• On-chip peptide mapping
mediante digestione con enzimi proteolitici (es. Tripsina)

Download Report