サーマルサイクリングのための VeriFlex温度制御テクノロジー

アプリケーションノート
VeriFlex温度制御テクノロジー
サーマルサイクリングのための
VeriFlex温度制御テクノロジー
イントロダクション
金属ブロック上の直線的温度勾配
マンスは研究者とその研究にとって非常に重要です。サーマルサイクラーが制御する
温度、ランプ速度および保持時間は、PCR反応を成功させるためのきわめて重要な
パラメーターです。高性能サーマルサイクラーには、いかなる反応液量であっても液体
（反応）温度および保持時間を正確に制御することが要求されます。サーマルサイク
ブロックの温度 (˚C)
サーマルサイクリングはすべてのPCRの基本であり、サーマルサイクラーのパフォー
ラーによる温度制御および保持時間制御は、PCR最適化実験ではさらに重要です。
サーマルサイクラーには、通常のPCRランおよび PCR 最適化ランのいずれにおいて
も同一の性能が要求されます。本アプリケーションノートでは、Applied Biosystems™
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レーン
図1．直線グラジエント温度
VeriFlex™ ブロック温度制御テクノロジーを採用したシステムと通常のグラジエントブ
ロックを使用したシステムの構造を分析し、それぞれの性能を比較しました。
グラジエント温度制御とは？
グラジエント温度制御は、PCRプロトコールの最適な温度と保持時間を決定するた
めのPCR 最適化実験を、ユーザーが最小の実験数で実行できるようにサポートする
機能の1つです。理想的には、真のグラジエントでは図1のとおり、均質な金属ブロッ
ク全体で直線的な温度勾配が示されます。
現在市販されているグラジエントサーマルサイクラーでは、図2のとおり2つの独立し
図2 ．グラジエントサーマルサイクラーの構造
た加熱／冷却部が均質な金属ブロックの下に組み込まれていますが、このデザイン
には以下の問題があります。
金属ブロック上の標準的なグラジェント温度
ブロック上の他の温度を制御できません。
• 均質な金属ブロックの両端での高温と低温の間の熱相互作用のため、真の直線勾
配が達成されません。ブロック上の温度勾配は直線ではなくS字型に近い曲線を示
します（図3）。
温度 (˚C)
• グラジエントサーマルサイクラー上でユーザーが設定できるのは2点の温度のみで、
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73.5
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70.3
65.6
60.1
55.5
51
1
52.5
2
3
4
5
レーン
図3．非直線グラジエント温度
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VeriFlex ブロック温度制御とは？
VeriFlex テクノロジーを使用したサーマルサイクラーでは、図4のと
おり3つ以上の独立した加熱／冷却部が3つ以上の独立した金属ブ
ロックの下にそれぞれ組み込まれています。加熱／冷却部と金属ブ
ロックの各ペアは、熱相互作用を防ぐために完全に隔絶されていま
す。その結果、VeriFlexテクノロジーにより、図1のとおり金属ブロッ
ク上で真の直線温度勾配が実現し、最高6段階の温度設定が可能
となります。ユーザーは各温度ゾーンを独自に設定できるため、さ
らに高度な温度最適化の制御が実現します。
図4．VeriFlexテクノロジーの構造
VeriFlex テクノロジーと通常グラジエントの比較
材料および方法
表1に示すシステムのすべての試験は、本セクションに記載する機
5の位置は、A3、A7およびA11の
ウェルの温度試験ポイント
種と方法を使用して行われました。
表1．試験をおこなったシステム
加熱カバーの温度試験ポイント
機種名
Applied Biosystems™ ProFlex™ 1 x 96-Well PCR システム
リボンケーブル
Applied Biosystems™ SimpliAmp™ サーマルサイクラー
T社 D製品
図5．VeriFlex Temperature Verification Kitの温度プローブの配置図
B社 T製品
B社 C製品
E社 MN製品
VeriFlexテクノロジーと通常グラジエントブロックの精度の比較
ここでは、各システムのグラジエントまたはVeriFlexテクノロジー
を使用して温度変動の試験を行いました。一般的なアニーリング
温度である60℃をおおよその中央値として使用し、各ブロックに関
ブロック温度は、National Institute of Standards and Technology
してシステムが許容する最大限の温度範囲の試験を行いました。
（NIST ）-traceable Applied Biosystems™ VeriFlex™ 96-well
数種類の温度設定、実際の測定値および算出された差を表 2に示
Temperature Verification Kit（製品番号4377669）を使用して
3つの温度プローブで測定しました。各プローブが8つの位置の温
度を測定するため、ブロック上のさまざまな位置で合計24の温度
を測定します。温度プローブのレイアウトの一例を図5に示します。
します。
温度は、横列、縦列、ゾーンのプローブ温度の平均値です。
表 2 ．20℃の範囲内のさまざまな設定ポイントにおける精度の例
Temperature
set point1 (°
C)
50.5
51.7
53.6
56.2
58.8
61.2
63.8
66.4
68.3
69.5
Block temp
measurement2
(°
C)
50.6
51.8
53.7
56.1
58.7
61.2
63.8
66.3
68.4
69.4
Delta3 (°
C)
0.1
0.1
0.1
–0.1 –0.1 0.0
0.0
-0.1
0.1
-0.1
1. サーマルサイクラーのインターフェース上に表示された値
2. VeriFlex 96-well Temperature Verification Kitで測定した値
3. 試験を行った各システムに関して、すべての温度範囲で観察された最大の温度差
を表3に示します
結果
各サーマルサイクラーの金属ブロック上で測定された温度プロファイルを図6に示します。VeriFlex ブロックの温度プロファイルは、ブロ
ック全体で真の直線勾配を示しています。他のすべてのグラジエントブロックは、非直線性の温度プロファイルを示し（赤色線）、レーン
間の温度差（青色バー）には一貫性が見られませんでした。レーン間の温度差に一貫性が見られない場合、特に困難なアッセイの最適化
ではアニーリング温度の真の最適化が困難になります。
4.00
65
3.00
60
2.00
55
50
1.00
45
0.00
2
3
4
5
6
70
2.64
2.40
55
1.00
0.24
0.00
45
1
2
3
4
5
6
10.00
10.00
6.00
55
4.00
50
2.00
45
0.00
3
80
7
8
9
10
11
12
3
60
1.50
55
1.50
5.10
5.00
4.00
3.20
3.00
3.00
1.90
1.80
55
2.00
50
1.00
45
0.00
1
0
45
1
2
3
4
Temperature
2
3
4
5
6
Lane-to-lane temperature difference
5
6
7
8
Lane
Lane
2
1
50
7
8
Lane-to-lane temperature difference
Gradient temperature
Nexus 96-well
gradient
E 社 MN
製品 profile
6.00
70
60
4
3.20
3.00
65
Gradient temperature
4.50
65
5
70
Lane
5.50
75
Temperature (˚C)
Temperature (˚C)
0.50
4.70
4.60
T100
gradient
B社
T 製品 profile
12.00
60
Lane-to-lane temperature difference
1.50
0.75
Lane-to-lane temperature difference
8.00
2
2.00
1.44
50
Temperature
65
1
2.50
6
5.50
75
Lane
Lane-to-lane temperature difference (˚C)
10.00
70
3.00
2.40
1.41
60
SimpliAmp temperature profile
75
2.64
65
Lane
Lane-to-lane temperature difference
3.50
3.12
75
2.60 2.60
70
Temperature (˚C)
1
75
2.40
2.50
1.90
65
60
3.00
2.60 2.60
1.90
1.20
55
2.00
0.50
50
1.50
1.20
0.50
1.00
0.50
0.00
45
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Lane-to-lane temperature difference (˚C)
70
5.00
80
Temperature (˚C)
5.00
Lane-to-lane temperature difference (˚C)
5.00
C1000 B
Touch
gradient profile
社 C 製品
4.00
3.60
3.36
Lane-to-lane temperature difference (˚C)
5.00
80
Temperature (˚C)
Temperature (˚C)
5.00
Lane-to-lane temperature difference (˚C)
5.00
75
6.00
Lane-to-lane temperature difference (˚C)
TouchT 社
gradient
D 製品profile
ProFlex temperature profile
80
Lane
Gradient temperature
Lane-to-lane temperature difference
Gradient temperature
図 6．サーマルサイクラー金属ブロック上の測定温度プロファイル
表3には、本試験で使用したシステムに関して入手可能な温度範囲および設定可能な温度の数の公表値ならびに、各システムに関する
設定ポイントと測定温度の差の最大値を示します。
表3 ．通常グラジエントと比較した、VeriFlexテクノロジーの温度精度
機種
温度範囲
範囲内で設定可能な
温度の数
精度（設定ポイントと
実測値の差の最大値）
Applied Biosystems Proflex PCR System
25°
C
6
–0.2°C @ 75°C
Applied Biosystems SimpliAmp Thermal Cycler
20°
C
3
0.0 @ 60°C
T社 D製品
24°
C
12
–0.8°C @ 58.9°C
B社 T製品
25°
C
8
+0.6°C @ 50°C
B社 C製品
24°C
8
–1.2°C @ 75°C
E社 MNG製品
12°
C
8
–0.4°C @ 61.8°C
まとめ
通常グラジエント
VeriFlexテクノロジー
1個の均質な金属ブロック
複数のセグメントからなる金属ブロック
温度の設定ポイントは、1個の金属ブロックの両端の2点のみ
金属ブロックの各セグメントに関して温度が設定可能
金属ブロック上の温度は非直線的
金属ブロックの複数のセグメント間で温度が直線的
グラジエント実験中、金属ブロック上の温度保持時間が
異なる
温度保持時間を正確に設定できるデザイン
グラジエント実験中に小さな温度差を特定するのが困難
金属ブロックの各セグメントでの独立した正確な温度制御が容易に
実行できるため、0.1 ℃の温度差でも特定可能
グラジエントモードの温度制御が正常モードの温度制御と
一致しない可能性あり
VeriFlexモード／正常モードのいずれでも温度精度を維持
VeriFlexテクノロジーのその他のアプリケーション
VeriFlex ブロックはPCR最適化に、通常グラジエントよりも優れた方法を提供します。VeriFlex ブロックは温度制御システムによって
個別に制御される、複数のゾーンを有するペルチェブロックとして提供されます。断熱材で各ペルチェブロックを物理的に独立させ、隣
接するブロック間の温度干渉を最小限にします。その結果、複数の温度ゾーンで正確な温度制御が可能となります。
• 最適なアニーリング温度がきわめて正確に特定されるので、推測の必要がなくなります
• 時間を節約し、1回のPCRラン実験でアニーリング温度の異なる複数の反応を同時に実行します
• サーマルサイクラーを、複数の正確なインキュベーション温度設定が可能なインキュベーターとして使用できます
「たまたま増えた」
とは言わせない
VeriFlex 機能搭載サーマルサイクラ―
ProFlex PCRシステム
Veriti サーマルサイクラー
SimpliAmp サーマルサイクラー
詳細はこちらをご覧ください www.thermofisher.com/thermalcyclers
研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。
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販売店
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