AMPK Enhances Insulin-Stimulated GLUT4 Regulation via Lowering Membrane Cholesterol Endocrinology, May 2012, 153(5):2130–2141 AMPKは膜のコレステロール量を低下させることで、 インスリン刺激によるGLUT4の膜移行を促進する。 2015/06/01 M1 眞野 僚 骨格筋における糖取り込みのメカニズム Sakamoto K and Holman GD, Am J Physiol Endocrinol Metab, 295: E29–E37, 2008 コレステロールの生合成について ←←←←←←←（以下ACCと表記） ←律速酵素 (以下HMGRと表記) http://www.f-gtc.or.jp/ketogenic/AMPK-FOXO.html 背景と目的 ・細胞膜上の過剰のコレステロールは、インスリンシグナルのリン酸化を阻害すること なく、F-actinの構造を破壊することで、インスリン誘導性の糖取り込みを阻害した。1) ・膜の流動性が穏やかに上昇することで、糖取り込み量が増加した。2) ・AMPKは、コレステロール合成の律速酵素であるHMGRを阻害した。3) ・AMPKの活性化は、SREBPの活性を抑制した。3) 本研究では、 ①AMPKの活性化が細胞膜のコレステロール量とGLUT4の膜移行に 及ぼす影響 ②AMPKの活性化が高インスリン状態時に上昇する細胞膜のコレステ ロールを制御できるかどうかについて検討を行った。 1)Elmendorf JS et al, Diabetologia, 2012 2) Czech MP et al, Diabetes, 1980 3)Liu ZM et al, Biochem Biophys Res Commun, 2008 AMPKの活性化がL6-GLUT4myc筋管細胞で起こるか確認 １．GLUT4にmycを導入した L6筋芽細胞を筋管細胞に分化 ２．血清飢餓30分 ３．1 mM AICARを45分添加、 または200 µM DNPを30分添加 ４．細胞を回収し、ウエスタンブロット AICAR DNP AMP/ATP↑ P AMPK P ACC AMPKの活性化を引き起こすこと を確認した。 inactive AMPKの活性化がGLUT4の膜移行を引き起こすか確認 緑：GLUT4-myc 赤：核酸 １．GLUT4にmycを導入したL6筋芽細胞 を筋管細胞に分化 ２．血清飢餓30分 ３．AICAR、DNPを添加 （100 nM インスリンで20分刺激） ４．Mycに対する抗体を用いて免疫染色 （核は、Syto60を用いて染色し、 蛍光強度を測定した） AMPKの活性化はGLUT4の膜移 行を促進することを確認した。 AMPKの活性化はインスリンシグナルに影響を及ぼすのか？ １．GLUT4にmycを導入したL6筋芽細 胞を筋管細胞に分化 ２．血清飢餓30分 ３．AICAR、DNPの添加 （インスリンの添加） ４．細胞を回収し、それぞれの抗体を 用いてウエスタンブロット AMPKの活性化は、IRS-1、 Akt2、AS160のリン酸化に は影響を及ぼさなかった。 ⇒インスリンシグナルとは別 の経路でGLUT4の膜移行を 促進している。 AMPKの活性化が細胞膜のChol量に与える影響 １．GLUT4にmycを導入したL6筋芽細胞を筋管細胞に分化 ２．血清飢餓30分 ３．AICAR、DNPの添加 ４．コレステロール量をamplex red cholesterol assayで 測定した。 AMPKの活性化により、細胞膜のコレス テロール量が有意に減少した。 外因性のCholの添加が細胞膜のChol量に与える影響 １．GLUT4にmycを導入したL6筋芽細胞を筋管細 胞に分化 ２．血清飢餓30分 ３．AICAR、DNPの添加 (２－３の間に、1 mM βCD:Cholを同時に添加) ４．コレステロール量をamplex red cholesterol assayで測定した。 βCD:Cholの添加により、細胞膜の コレステロール量が減少しなかった。 βCD:Chol : methyl-β-cyclodextrin preloaded with cholesterol 細胞膜のChol量の変化がGLUT4の膜移行に与える影響 １．GLUT4にmycを導入したL6筋芽細胞を 筋管細胞に分化 ２．血清飢餓30分 ３．AICAR、DNPの添加 (２－３の間に、1 mM βCD:Cholを同時に添加) ４．Mycに対する抗体を用いて免疫染色 （核は、Syto60を用いて染色し、蛍光強度を測定した） βCD:Cholの添加により、 AMPKが促進するインスリ ン誘導性のGLUT4の膜移 行のみを阻害する。 AMPKのノックダウンが細胞膜のChol量に与える影響 １．GLUT4にmycを導入したL6筋芽細胞 を筋管細胞に分化 （２．細胞播種後、siRNAをトランスフェク ションして、AMPKをノックダウン） ３．血清飢餓30分 ４．AICAR、DNPの添加 ５．A:細胞を回収してウエスタンブロット B：コレステロールを定量 siRNAのトランスフェクションによって、AMPKの発現量が減 り、それに伴って細胞膜上のコレステロール量がControlに 比べて増加した。 AMPKのノックダウンがGLUT4の膜移行に与える影響 １．GLUT4にmycを導入したL6筋芽細胞を 筋管細胞に分化 （２．細胞播種後、siRNAをトランスフェクションして、 AMPKをノックダウン） ３．血清飢餓30分 ４．AICAR、DNPの添加 （インスリンの添加） ５．Mycに対する抗体を用いて免疫染色 （核は、Syto60を用いて染色し、蛍光強度を測定した） AMPKによるインスリ ン誘導性のGLUT4の 膜移行の促進を抑制 した。 高インスリン状態が細胞膜のChol、F-actinに与える影響 １．GLUT4にmycを導入した L6筋芽細胞を筋管細胞に分化 ２．血清飢餓30分 ３．AICARの添加 （5 nM インスリン 12時間刺激） ４．コレステロール量をamplex red cholesterol assayで 測定した。 ４．F-actinに対する抗体を用いて 免疫染色 AMPKの活性化によ り、Chol量の増加、 F-actinの破壊は抑 制された。 高インスリン状態がGLUT4の膜移行に与える影響 １．GLUT4にmycを導入したL6筋芽 細胞を筋管細胞に分化 ２．血清飢餓30分 ３．AICARを添加 （5 nM インスリンで12時間刺激） ４．100 nM インスリンで20分刺激 ５．Mycに対する抗体を用いて 免疫染色 （核は、Syto60を用いて染色し、 蛍光強度を測定した） AMPKの活性化により、インスリン抵抗性を有するときでもイ ンスリン誘導性のGLUT4の膜移行を促進した。 in vivoにおけるF-actin、Chol量の変化 １．6週齢の雌のZucker ratを購入 ２．2週間の順化後、食後のラットから 組織を単離した Fig.A １．Lean/Obese Zucker ratsから 滑車上部筋を単離 ２．F-actinに対する抗体でラべリング ３．共焦点顕微鏡で観察 Fig.B １．単離したヒラメ筋のコレステロール 量を定量 高インスリン血症を有するObese ratsは、F-actinの減少、 細胞膜のChol量の増加が確認された。 Cholの減少が肥満型ラットの糖取り込みに与える影響 １．ヒラメ筋を単離 ２．2.5 mM βCDを60分添加 １．ヒラメ筋を単離 ２．2.5 mM βCDを60分添加 （13.3 nM インスリンを30分添加） ３．F-actinに対する抗体でラベリングし、 観察 ３．8 mM 2-[1,2-3H]DGを含む バッファーで培養し、放射活性を測定 βCDの添加によってコレステロール量を減らすことで、糖取 り込み能が改善し、F-actinも回復した。 まとめ ・AMPKによるGLUT4の制御には、細胞膜のコレステロール の低下が関わる。 ・AMPKの活性化はインスリン抵抗性の改善にも寄与するこ とができる。 Supplemental fig.1 推測されるモデル Fig.4とFig.5のC、DのBar7の比較により、 ・AMPKには、コレステロール非依存の経路も存在すると示唆される。 ⇒おそらくAS160以降のシグナルが存在しそう 筆者らの先行論文 βCDの添加によって、GLUT4の膜移 行と2-DGの取り込みは回復する しかし、Aktのリン酸化は回復しなかった。 ⇒AMPKはAS160以降に関与する可能性 あり βCDの添加により、basal , Insulin-stimulatedのどちらも上昇した。 ①AICARやDNPよりβCDの方がコレステロールが減少しているので、GLUT4のエンドサイ トーシスを阻害しているのかも⇒GLUT4が膜に留まる ②βCDがAMPKのactivatorであるかも？ 変わらないので、βCDがAMPKの活性剤である可能性を否定 Amy J. Davidoff , Proceedings of the Australian Physiological Society , 2005
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