核酸の新規安定化技術の開発と、遺伝子 分析ならびに医薬品への応用 産業技術総合研究所 生物プロセス研究部門 小松康雄 1 2本鎖核酸と特徴 2本鎖形成は多様な技術で関わる １本鎖 2本鎖 • 遺伝子の検出、制御 • 配列解析 • 機能性核酸 • 核酸医薬 • 導電性 etc 通常の2本鎖は外的因子、配列の影響を受ける。 安定な形成には一定以上鎖長、修飾核酸等が必要になる 2 2本鎖の安定化と課題 • 2本鎖の安定化が可能 2本鎖核酸のクロス リンク（CL） • DNAの損傷、抗がん剤 • 配列選択的に機能を抑制 構造的な歪みが生じる 反応の特異性と簡便性 Crit Rev Biochem Mol Biol. 2010, 45, 23–49. Nature Reviews Cancer 11, 467-480. 3 紹介する技術 1. 2本鎖核酸の新規なクロスリンク （CL)技術とその性質 2. 応用例 CL2本鎖を利用したプローブ開発 4 新規な2本鎖CL反応 脱塩基部位 脱塩基部位のペアー O O O OH H OH O O O 反応 塩基対 クロスリンク（CL）2本鎖 クロスリンク （CL) 5’ 3’ 3’ 5’ • 簡便な連結法 • 位置選択的に複数導入 可能 J. Am. Chem. Soc., 131 (37), 13208–13209 (2009). Chem. Commun. (Camb) 48, 2143-2145 (2012). 特許5196448 5 新規なCL2本鎖の性質 2’-O-methyl RNAの2本鎖 Mediator (med) 通常のDNA 5’ CGGAGCAGCAGC 3’ 3’ GCCUCGUCGUCG 5’ 5’ CGGAGCXGCAGC 3’ 3’ GCCUCGXCGUCG 5’ mDS mCL 1.E+06 曲がる ↓ 直接電子移動 O HO O P 25℃ 80℃ 6.E+05 2.E+05 O OS S e- -2.E+05 220 240 260 280 300 320 電極 -6.E+05 8.E+05 CL-DNA CL2本鎖 へリックス構造を 維持 6.E+05 分子楕円率（θ） 剛直構造 through base pairs へリックス構造破壊 4.E+05 通常の2本鎖 2.E+05 0.E+00 e- e- 65 70 75 80 85 温度（℃） Chem. Lett., 41, 62-64 (2012) . Langmuir, 28, 17211-17216 (2012) . 高温でもへリックス構造を維持可能 6 これまでのCL-DNAの活用例 解離しない、安定、鎖長可変、簡便 スクリーニング 微小電極上への酵素の配置 電流計測 マイクロ電極 e- 電極 抗がん剤の薬剤耐性を上げる物質のスクリーニング系構築 に本CL構造が利用された （通常のCLよりも修復酵素に認識されにくいことが利用） （国外） FcOH+ FcOH 酵素 B H2O H2O2 O2 酵素 A グルコース GDL Bioorg Med Chem., 23, 6912 (2015) 7 CL2本鎖を新規なプローブに利用 従来の核酸プローブ例 標的核酸 プローブ 標的核酸との結合配列の近傍に導入したプローブを作製 CL CL2本鎖-1本鎖 1. 隣接ハイブリへの影響 2. microRNA(miRNA)に対する影響 8 CL2本鎖による隣接ハイブリの安定化 プローブ：DNA 標的：RNA（22 mer） プローブ dSS-I dDS-I I Tm (℃) (ΔTm） 結合の安定性の指標 44.7 43.3 (0) 融解曲線 0.2 変化無し ΔA260 標的RNA 0.15 0.1 target (-) 0.05 43.7 (0.4) 0 dhp-I 20 43.9 (-0.8) 40 60 温度（℃） 80 0.2 ΔA260 0.15 CLプローブ dCL-I 54.9 (11.6) 0.1 Tm上昇 0.05 target (-) 0 20 dCLhp-I 56.2 (12.9) 上昇 59.2 (15.9) 40 60 温度（℃） 80 9 新技術の効果 CL 安定化効果 CL-I 強固なヘリックス構造 hp-I CL2-I • • • • 隣接するハイブリを安定化 DNA, RNA, 修飾核酸いずれの場合においても安定化効果を有する CLx1で15℃、CLx2で20℃程度Tm値は上昇 核酸分解酵素に耐性（生体内持続性が高い） 10 紹介技術 1. 2本鎖核酸の新規なクロスリンク（CL) 技術とそのCL2本鎖の性質 2. 応用例 CL2本鎖を利用したプローブ開発 11 microRNAと阻害核酸 • miRNAに結合する核酸は核酸医薬品としても期待されている。 • 2本鎖含有AMOは、1本鎖よりも抑制活性が高い。そこで2本鎖部位 のCLを実施し、細胞内における効果を評価した。 細胞 Anti-miRNA oligo (AMO) DNA •転写 •Processing •核外輸送 •トリミング 1本鎖型 翻訳阻害 cap mRNA miRNAの相補鎖 切断・分解 RNA-induced silencing complex (RISC) 2本鎖型 A社 cap 結合 AAA…An 3’UTR 翻訳活性化 RNA, 13, 723, (2007) cap B社 AAA…An 3’UTR 5’UTR RISC-AMO 複合体 Nucl. Acids Res., 40, e58 (2012) miRNAの阻害 12 miRNA阻害核酸への導入 2’-O-methyl RNAで合成し、細胞内における活性を評価した miR-21 (miRNA) C U 5’ UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 3’ 1本鎖型 3’ GCCUCGUCGUCGAUCGAAUAGUCUGACUACAACUGCCUCGUCGUCG 5’ 2本鎖型 5’ CGGAGCAGCAGC CGGAGCAGCAGC 3’ 3’ GCCUCGUCGUCGAUCGAAUAGUCUGACUACAACUGCCUCGUCGUCG 5’ 12bp G U UCUCGA AGCUCU AGAGCUAUCGAAUAGUCUGACUACAACUUCGAGA Gene Ther. 2011, 18, 1111 G A A A stable loop ヘアピン ループ (HP)型 CL2本鎖 5’ CGGAGCXGCAGC CGGAGCXGCAGC 3’ 3’ GCCUCGXCGUCGAUCGAAUAGUCUGACUACAACUGCCUCGXCGUCG 5’ CL型 短鎖CL型 5’ CGGAGCXGCAGC CGGAGCXGCAGC 3’ 3’ GCCUCGXCGUCGAUCGAAUAGUGCCUCGXCGUCG 5’ CL2本鎖型は最も高い活性を示した 1.2 relative luc intensity 1 Dual luciferase assay 細胞内導入48 hr後に評価 0 nM 0.5 nM 1 nM 2 nM 3 nM 4 nM 5 nM 10 nM 0.8 0.6 0.4 0.2 0 A社 X X Tm 1本鎖型 2本鎖型 60.1℃ 61.6℃ HP型 60.1℃ CL型 82.2℃ mismatch 66.8℃ B社 短鎖CL型 13 新技術の特徴 ❑反応 • 安価な試薬で簡便な反応 ❑構造 • 連結部位はヘリックス内部に収まる ❑性質 • 剛直かつ低分子の2本鎖核酸を作製可能 • CL試薬に応じて性質が変化（e.g.芳香環→導電性） • 隣接するハイブリダイゼーションを高度に安定化 • 細胞内においても持続的効果を示す 14 本技術に関する知的財産権 CL試薬関連の特許 • • • • 発明の名称：アミノオキシ基含有の反応性化合物 出願番号 ：特許5196448 出願人 ：産総研、DNAチップ研究所 発明者 ：小松 康雄、小島 直、野中 謙 CLプローブのハイブリに関する特許 • 発明の名称：核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの形成方 法、医薬組成物、核酸検出用プローブ及び相補鎖核酸複合体 • 出願番号 ：特願2014-251847／PCT/JP2015/084402 • 出願人 ：産総研 • 発明者 ：小松 康雄、平野 悠、三重 安弘 15 企業への期待 •遺伝子検出にCL構造を有するプローブを 利用することで、高感度化が期待される。 •核酸医薬においては、低濃度化と作用の 持続性が想定される。 •CL試薬ならびにCL核酸は提供可能であ るため、共同研究さらには事業化を期待 する。 16 産学連携の経歴 核酸修飾用リンカーの開発を実施 リンカー A G C T 5’ 3’ ライセンス H19年 Sigma-Ald.(US）、H23年 ChemGene(US） 遺伝子解析、診断 DNA チップ研究所、日本ガイシ、東レ等 の各製品 リンカー H24年ジーンデザイン社（大阪） •特許第4336820号（2007年） •US Patent NO.7491857号（2008年）, DE1908829 (2014年) 活用例 ポリマー、ポ アガラス •特許第5808025号（2015年） 核酸医薬品 製薬企業 ・核酸医薬（前臨床試験） ・Human Pathway analysis、ハイブリ先生 （可視化チップ）、3D Gene Yeast Oligo chip、SNPs解析カスタムアレイ他 ポリエチレングリコール、コ レステロール等機能性分子 基礎研究 大学、研究機関 お問い合わせ先 国立研究開発法人 産業技術総合研究所 生命工学領域研究戦略部 イノベーションコーディネータ 新間 陽一 ＴＥＬ ０２９－８６２ － ６０３２ ＦＡＸ ０２９－８６２ － ６０４８ e-mail [email protected] 18
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