チ ロ シ ナ ーゼ の安 定 性 な らび に活 性 に及 ぼす 添 加 物 の影 響 石井智恵美 村尾枝里子*表 美守** TheStabilityofTyrosinaseand TheEffectofAdditivesonitsActivity ChiemiIsh 食 物 の 酵 素 褐 変 に は,酵 素 が 必 要 で あ り,酸 素,基 ErikoMurao,YoshimoriOmote 質の他 に酸 質 と す る 方 法 の 報 告 が あ る.'チ ロ シ ナ ー ゼ の 素 の な い条 件 下 で は酵 素 均 一 性 に つ い て は ハ ム ス タ ー メ ラ ノ ー マ8) と 基 質 が 存 在 し て も褐 変 反 応 が 進 行 す る こ と と マ ッ シ ュ ル ー ム の チ ロ シ ナ ー ゼ9)10)に は な い.こ イ ソザ イ ム の 存 在 の あ る こ とが す で に 報 告 さ の 反 応 に 関 与 す る 酵 素 は,1895年 に チ ロ シ ン を 酸 化 し て 禍 変 させ る 反 応 を 触 媒 れ て い る.ポ す る もの と して発 見 され た た め チ ロ シ ナ ー ゼ 害 に つ い て は,シ 後 にモ ノ フ ェ ノ ー ル モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と命 酸 に よ る も の の 他,カ 名 さ れ,銅 合 物11),脂 を 含 む 酸 化 酵 素 と して 酵 素 番 号 [1.14.18.1]を 与 え ら れ て い る.褐 変 に関 食 塩14)な リフ ェ ノ ー ル オキ シ ダ ー ゼ の 阻 ア ンイ オ ンや プ ロ トカ テ ク ル ボ ン 酸,ハ 肪 族 ア ル コ ー ル12),亜 つ い て は,バ る こ とが 知 ら れ て お り,市 素 に つ い て 若 干 の 報 告 が あ る.最 も マ ッ シ ュ ル ー ム を 原 料 と し て い る が,モ ロ ゲ ン化 硫 酸 塩13), ど 報 告 は 多 く見 ら れ る.安 与 す る 酵 素 は 古 くか ら き の こ類 に 含 ま れ て い 販 のチ ロシナーゼ ア ナ ナ15),ナ 定性 に ス16)に 含 ま れ る 酵 近 はチ ロシ ノ ナ ー ゼ の 阻 害 の モ デ ル 実 験17)が 行 わ れ,ま た, フ ェ ノ ∵ ル 類 を酸 化 す るチ ロ シ ナ ーゼ とジ フ メ ラ ニ ン モ デ ル と し て イ ン ド キ ノ ン の4位 と ェ ノ ー ル類 を酸 化 す る ラ ッカ ー ゼ と に分 け て 7位 の 結 合18)が 論 じ ら れ る こ と が 多 か っ た.し か し な が ら, 著 者 ら は,マ 提 案 さ れ て い る. ッシ ュル ー ム とシ イ タケ を生 両 酵 素 が モ ノ フ ェ ノ ー ル もジ フ ェ ノ ー ル も酸 で 保 存 し た 場 合,マ 化 す る 能 力 を 持 つ な ど 曖 昧 な 点 が 多 い た め, 褐 変 酵 素 の 活 性 低 下 が 著 し い こ と,マ 現 在 で は フ ェ ノー ル 類 の褐 変 に関 与 す る 酵 素 ル ー ム と シ イ タ ケ よ り得 た 粗 酵 素 の 基 質 特 異 を総 称 して ポ リ フ ェ ノ ー ル オ キ シ ダ ー ゼ あ る い は フ ェ ノ ー ル オキ シ ダ ー ゼ と呼 ば れ る こ と 性 と 阻 害 の 様 式 が 異 な る こ と を 既 に 報 告19) 20)し た .そ こ で 反 応 系 を よ り単 純 化 す る た が 多 い.近 め に 市 販 の チ ロ シ ナ ー ゼ を 用 い,酵 年 で は シ イ タ ケ1),カ ベ ツ2),桃3),南 tenuis(菌 類)5)の は フ ロ ロ グ ル シ ン6)や 践女子大学**筑 素 と して 性 に 及 ぼ す 影 響 を観 察 し た の で 報 告 す る. 素 活性 測 定 法 に つ い て ク ロ ロ ゲ ン 酸7)を ッシ ュ の 安 定 性 を検 討 す る と と もに添 加 物 の 酵 素 活 ポ リ フ ェ ノ ー ル オキ シ ダ ーゼ の報 告 が あ り ,酵 *実 ッ トキ ャ 極 オ キ ア ミ4),Alterna・i・ ッシ ュル ー ム に含 ま れ る 基 波大学名誉教授 一95一 実験方法 1.試 結果と考察 薬 1.チ 本 実 験 で は 試 薬 は す べ て 特 級(SIGMA) ロシナーゼ水溶液 の安定性 チ ロ シ ナ ー ゼ 水 溶 液 を6℃ を 用 い た. し,一 2.活 応 さ せ た.酵 性試験 ね じ 口 試 験 管 に0.1Mリ 6.8)3.6ml,蒸 mlを ン 酸 緩 衝 液(pH 留 水0.2ml,基 入 れ 恒 温 漕(30℃)で 応 開 始2分 れ に チ ロ シ ナ ー ゼ 水 溶 液(1mg/ml)0.2mlを 加 え,反 応 を 開 始 さ せ る.タ に保 存 基 質 と して 反 素 反 応 速 度 はそ の反 応 の 初 期 に お け る反 後 の 吸 光 度 を 求 め,保 光 度 を100%と ,果,一38℃ ッチ ミ キ サ ー で 正 確 に10秒 反 応 液 を 攪 拌 後,庫 定 日 数 後 にL-DOPAを お い て 最 大 で あ る た'め,475nmに 質 水 溶 液2 温 め る.こ と 一38℃ 存0日 し て 比 較 し た(図1).そ の吸 の結 で 保 存 し た も の は45,75,100日 後 に お い て も 吸 光 度 の 低 下 は 見 ら れ な か っ た. 内 の 温 度 を一 定(30℃)に 設 定 し た 分 光 光 度 計(島 UV-2200)に て 吸 光 度 を 測 定 し た. 津 本 実 験 は基 質 が 光 に よ っ て 酸 化 さ れ呈 色 す る 可 能 性 が あ る た め 遮 光 し て 行 っ た. 3.チ ロシナーゼの安定性 (1)水 溶 液 状 態 にお け る 安 定 性 チ ロ シ ナ ー.ゼ水 溶 液(1mg/ml)を 口 試 験 管 に 分 注 し,6℃ と 一38℃ ね じ に 保 存 し た. 活 性 試 験:はL-DOPAを 基 質 と し た た め,吸 光 度 測 定 はL-DOPAの 酸化 生産物 の吸収 極 大 で あ る475nmで (2)粉 行 った ・ 末 状 態 にお け る安 定 性 チ ロ シ ナ ー ゼ を粉 末 の ま ま25℃ 存 し,L-DOPAを 基 質 と し て1ケ と35℃ に 保 月 ご とに 活 性 を 測 定 し た(475nm). 4.基 質 と呈 色 基 質 と し て チ ロ シ ン,カ ル,L-DOPAを さ せ,呈 テ キ ン,カ テ コー 用 い て チ ロ シ ナ ー ゼ と反 応 色 物 質 の 吸 収 ス ペ ク トル を 観 察 し た. 5、 添 加 物 の 影 響 コ ル ビ ン酸,リ イ ド ロ キ ノ ン,グ ア ミ ド,シ ス チ ン,シ 質 はL-DOPAと 一方 ,6℃ で 保 存 し た も の は7日 日 後 で77%,45日 後 で60%,70日 100日 後 で39%と な り,反 後82%,14 後 で45%, 応初 速度 にかな り の 低 下 が 生 ず る こ とが 分 か る.そ 添 加 物 と し てﾎス ン,ハ Fig.1Stabilityoftyrosinasestored asaqueoussolution. ル コ ー ス,ニ こで両者の ボフ ラビ 反 応 低 下 の お お よ そ の 速 度 を 求 め る た め に, コチ ン み か け 上 反 応 生 産 物 量 が 最 大 に な る 反 応20分 ス テ イ ン を 用 い た.基 後 の 吸 光 度 を 用 い て 活 性 の 残 存 率 を 求 め る こ' して 以 下 活 性 試 験 に準 じて と と し た.ま 活 性 を 測 定 し た. ず 保 存0日 の 酵 素 に よ って得 ら れ る 反 応 生 産 物 の 量 は0.462で を45日 間6℃ と 一38ｰCで あ っ た.こ 保 存 し た 場 合,得 れ る 生 産 物 量 は そ れ ぞ れ0.280と0.448で 従 っ て45日 後 の 活 性 の 残 存 率 は6℃ 一96一 れ ら あ り, で60.6%, 一38℃ で96 .8%と な る.こ れ を 一 次 反 応 とみ 3.基 な して 反 応 速 度 定 数kで 表 す と,6℃ はk =1.29×10-7,一38℃ はk=8.37× 』10-9 ナ ーゼ 存 在 下 で 酸 化 重 合 して で きる色 素 の構 と な り酵 素 の 不 活 性 化 の 速 度 が 大 き く異 な る 造 は そ れ ぞ れ に異 な る と考 え ら れ る.そ こ とが 分 か る.最 初 の45日 とい う単 位 で み る モ ノ フ ェ ノ ー ル と してL一 チ ロ シ ン,ジ フ ェ 限 り,酵 素 を水 溶 液 で6℃ ノ ー ル と してL-DOPAと 質 に よ る呈 色 の 違 い の 比 較 基 質 の カ テ コ ー ル部 分 が 共 通 で も,チ ロ シ に保 存 す る と,一 こ で, カ テ コ ー ル,ポ リ 38℃ に 保 存 した場 合 と比 較 して 約15倍 の 速 度 フ ェ ノ ー ル と して カ テ キ ン を用 い,反 応 生 産 で 不 活性 化 が 進 行 す る こ とが分 か る。 速 度 低 物 の 吸 収 ス ペ ク トル を経 時 的 に60分 まで 測 定 下 の比 較 に2分 後 の 吸 光 度 を用 い な か った の し,30分 まで を 図 に示 した(図3,4,.5, は,一38℃ 6).L一 チ ロ シ ンの場 合可 視 部 に お け る吸 保 存 に 活 性 低 下 が 見 られ な か っ た た め,計 算 上 比 較 す る こ とが 難 しか っ た か ら 収 極 大 は480nm付 で あ る. の 経 過 とと 、 も に 変 化 し,測 2.チ nmか.ら490nmに ロ シナ ー ゼ 粉 末 の 安 定 性 近 に あ る が,こ れ は時 間 定60分 間 に473 まで 移 動 す る.吸 光 度 は60 市 販 の チ ロ シ ナ ーゼ(凍 結 真 空 乾 燥 粉 末) 分 ま で 上 昇 し続 け るが,反 応 速 度 は10分 以 降 を そ の ま ま の状 態 で 密 封 し25℃ と35℃ に 保 存 徐 々に低 下 す る.ま た ベ ー ス ラ イ ンの 上 昇 も した.市 販 の酵 素 は凍 結 真 空 乾 燥 粉 末 で あ る 見 ら れ る.L-DOPAの 場 合 が 多 く,こ れ を冷 凍 す れ ば 長 期 間 安 定 に nm付 保 存 で き る こ と は,既 に広 く受 け入 れ られ て 最 大 と な る.そ の 後 吸 光 度 は減 少 す る.一 方 い る 事 実 で あ る.し か しな が ら,図2に で は 紫 外 部 の吸 光 度 が 上 昇 しは じめ,ベ 示す 場 合 吸 収 極 大 は480 近 で あ り,吸 光 度 は反 応 開 始20分 後 に ース よ う に25℃ とい うか な り高 温 で の保 存 にお い ラ イ ンの 極 端 な 上 昇 も見 ら れ る.カ て60日 まで 酵 素 の 活 性 が低 下 しな か った の は の 場 合 吸 収 極 大 は410nm付 予 想 外 で あ った.一 方,『35℃ で は30日 後 に す 光 度 は反 応 開始5分 で に活 性 が60%に し続 け た.ベ ー ス ラ イ ン の上 昇 は 認 め られ な ま で低 下 した. か った.カ テ コー ル 近 で あ る が,吸 後 に最 大 とな り後 は 減 少 テ キ ンの 場 合 可 視 部 に ピ ー クが2 つ あ り,両 者 と も時 間 の 経 過 と と もに増 大 し 続 け た.吸 光 曲 線 は60分 ま で 測 定 した が,恐 ら く測 定 限界 を こ えて い る と思 わ れ る た め, 10分 まで の 曲線 を示 した(図6).吸 光度は 60分 まで 上 昇 し続 け,ベ ー ス ラ イ ンの 上 昇 も 見 ら れ な か った.以 上 の結 果 よ り,基 質 が 異 な れ ば生 産物 も そ れぞ れ特 有 の 呈 色 を して い る こ とが 分 か る.一 度 上 昇 した 吸 光 度 が そ の 後 低 下 し,そ れ に伴 っ て紫 外 部 の吸 光 度 が 上 昇 す る こ と は,基 質 の酸 化 生 産 物 が さ ら に別 の もの に変 化 して い ぐこ と を示 唆Lて お り, ベ ー ス ラ イ ン の 上昇 は酸 化 生 産 物 が 重 合 して 分 子 量 が 大 き くな り不 溶性 に な っ た 結 果 と も ・ 考 え られ る. 4.チ Fig.2Stabilityoftyrosinasestored aslyophilizedpowder. ロ シナ ー ゼ 活性 に 及 ぼ す 添 加 物 の 影 響 L一 ア ス コ ル ビ ン酸 は ポ リ フ ェ ノ ー ル オ キ 一97一 Fig.3Absorptionspectrumofcolored productatgiventime. Fig.5Absorptionspectrumofcolored productatgiventime. Fig.4Absorptionspectrumofcolored productatgiventime. Fig.6Absorptionspectrumofcolored productat'giventime. 98 シ ダ ーゼ に よ って 酸 化 され褐 変 した物 質 を還 い.ま 元 して も と の 無 色 の物 質 に も どす 働 き11)21) イ ン と シ ス チ ンの:影響 を み た の が 図9で の あ る こ とは 既 に よ く知 られ て い る こ とで あ シ ス テ イ ン は 阻 害 作 用 を示 す が シ ス テ イ ンが る.そ た 一SHの 酸 化 還 元 の 立 場 か らシ ス テ こ でL一 ア ス コ ル ビ ン酸 を標 準 添 加 物 と して リボ フ ラ ビ ン,ニ グ ル コrス,ハ コ チ ン ア ミ ド,D一 イ ドロ キ ノ ン,シ ス チ ン,シ ス テ イ ンの 及 ぼ す 影 響 を比 較 した.リ ボ フ ラ ビ ン は 生 体 内 で は リ ン 酸 エ ス テ ル(FMN, FAD)'ど して存 在 し,生 体 内 の 酸 化 還 元 に 関 与 して い る た め,何 らか の 影 響 を及 ぼ す と '考 え た .そ の 結 果 褐 変 抑 制 作 用 を示 し た が, リボ フ ラ ビ ン の溶 解 度 が 低 い た め 反 応 液 中 の リ ボ フ ラ ビ ン濃 度50μMま で の 検 討 と した' (図7).・ ニ コ チ ン ア ミ ドは 脱 水 素 酵 素 の 補 酵 素NAD+に 素FAD.に 含 まれ,リ ボ フ ラ ビ ンが 補 酵 含 ま れ て い る こ と と対 応 す る.な お 酸 化 還 元 の見 地 か ら還 元 糖 と してD一 グ ル コ ー ス,還 元 性 化 合 物 と して ハ イ ドロ キ ノ ン を比 較 検 討 し た(図8).ハ イ ドロ キ ノ ンが 酵 素 反 応 の 活 性 化 に働 くの は,こ の もの 自体 が 基 質 と して呈 色 反 応 に加 わ るた め と考 え ら Fig.8Effectofhydroquinone,glucose, andnicotinamideontyrosinase activity. れ る.1グ ル コ ー ス は ほ とん ど影 響 が 見 られ な い.ニ コチ ンア ミ ドは 阻害 作 用 を示 した が, L一 ア ス コ ル ビ ン酸 と比 べ る とそ の作 用 は弱 Fig.9Effectofcysteineandcystine ontyrosinaseactivity. Fi9.7EffectofレascQrbicacidand riboflavinontyrosinaseactivity. 一99一 あ り, 示 さ な い こ と は当 然 で あ る と考 え られ る. 8)Pomerantz,S.h.:J.Biol.Chem.,238,2351(1963). 9)Moore,B.M.andFlurkey,W.H.:J.FoodSci., 要約 (1)市 54,1377(1989). 販 のチ ロシナーゼの安定性 を水溶 液 状 態 で6℃ と 一38℃ で 保 存 し た 場 合 と,さ に 粉 末 状 態 で25℃ ら と35℃ で 保 存 し た 場 合 に つ い て 検 討 し た.粉 末 状 態 で 保 存 し た 場 合,25℃ で は 保 存60日 テ キ ン,カ テ コ ー ル, J.Agric.FoodChem.,38,1097(1990). 13)Sayavedra-Soto,L.A.andMontgomery,M. ス ペ ク トル を 経 時 的 に 測 定 し た. ア ス コ ル ビ ン 酸,リ W.:J.FoodSci.,51,1531(1986). ボ フ ラ ビ ン, 14)黒 ニ コチ ン ア ミ ドはい ず れ もチ ロ シ ナ ー ゼ 作 用 を 抑 制 し た.グ ル コ ー ス の影 響 は認 め られ な FoodAgric.,51,223(1990). 口優 一 ・山 下 市 二 17)Maddaluno,J.F.andFaull,K.F.:Experientia, ・青 木 章 平:日 本 食 品 低 44,885(1988). 和 義 彦 木 柾 吉:食 ・細 田 浩 18)Raghavan,P.R.,Zane,P.A.andTripp,S.L.: ・椎 名 武 夫 ・伊 藤 裕 朗 ・黒 Experientia,46,77(1990). 総 研 報,50,65(1987). 19)石 3)Lee,C.Y.,Kagan,V.,Jaworski,A.W.and Brown,S.K.:J.Agric.FoodChem.,38,99(1990). Sci.Fish.,46,1035(1980). 野 哲 三 ・黒 田 柾 吉:日 ・藤 田 修 二 玉 枝 里 子,横 恵 美,表 美 守:実 山 裕 樹 子,倉 美 守:実 山 裕 樹 子,津 久 践 女 子 大 学 家 21)Hsu,A.F.,Shieh,J.J.,Bills,D.D.andWhite, 食 工 誌, K.:J.FoodSci.,53,765(1988). 36,920(1989). 一100一 田 元 子,石 井 智 践 女 子 大 学 家 政 学 部 紀 要, 30,31(1993). 食 工 誌,16,135(1969). ・李 忠 富:日 玉 枝 里 子,横 田 元 子,表 政 学 部 紀 要,29,87(1992). 20)児 5)Motoda,S.:J.Ferment.Technol.,57,71(1979). 田 芳 之 井 智 恵 美,児 井 朝 野,倉 4)Oshima,T.andNagayama,F.:Bull.Jpn.Soc. 7)東 ter,C.:J.Sci. 46,115(1988). 献 温 保 蔵 学 会 誌,14,59(1988). 6)塩 理 科 学,17,242(1984). 16)Fujita,S.andTono,T.:J.Sci.FoodAgric. 文 2)名 澤 祝 子:調 15)Cano,P.,Marin,M.A.andF か っ た. 1)山 P.M,andNicolas,J.J.:J.Agric.FoodChem., 12)Valero,E.,Varbn,R.andF.Garcia-Carmona: チ ロ シ ン を基 質 と した と きの 呈 色 物 質 の 吸 収 (3)L一 11)Janovitz-Klapp,A.H.,Richard,F.C.,Goupy, 38,926(1990). ま で 活 性 は 低 下 し な か っ た. (2)L-DOPA,カ 10)Flurkey,W.H.:J.FoodSci.,56,93(1991).
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