Regulation der Knospung von retrograden Transportvesikeln in der

Jahrbuch 2004/2005 | Spang, Anne | Regulation der Knospung von retrograden Transportvesikeln in der Hefe
Saccharomyces cerevisiae
Regulation der Knospung von retrograden Transportvesikeln in der
Hefe Saccharomyces cerevisiae
Regulation of the budding of retrograde transport vesicles in yeast
Saccharomyces cerevisiae
Spang, Anne
Friedrich-Miescher-Laboratorium für biologische Arbeitsgruppen in der Max-Planck-Gesellschaft, Tübingen
Korrespondierender Autor
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Zusammenfassung
Membran- und Proteintransport sind essenzielle Vorgänge in der Zelle. Die meisten Organellen innerhalb einer
Zelle sind von Membranen umgeben, die das unkontrollierte Vermischen deren Inhalts mit dem Cytoplasma
verhindern sollen. Die Kommunikation zw ischen verschiedenen Organellen w ird durch Membranhohlkugeln, so
genannte Vesikel, vermittelt. W ir untersuchen die Regulation von Protein- und Membrantransport in
verschiedenen Organismen. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae beschäftigen w ir uns hauptsächlich mit
dem Lebenszyklus eines Transportvesikels, das am Golgi-Apparat gebildet und mit dem endoplasmatischen
Retikulum verschmelzen w ird. Dahingegen untersuchen w ir im Fadenw urm Caenorhabditis elegans, w ie
Membranen in die Teilungsebenen w ährend der Cytokinese transportiert w erden. Die Cytokinese stellt den
letzten Schritt in der Zellteilung dar: Nachdem die DNA gleichmäßig auf zw ei Pole in der Zelle verteilt w urde (in
der Mitose), w ird neue Membran an der Plasmamembran zw ischen den beiden Polen eingefügt. Diese neue
Membran teilt dann den Zellinhalt, w obei zw ei Zellen erhalten w erden.
Summary
Membrane and protein transport are essential processes in the cell. Proteins have to be delivered to the
correct cellular target compartment to fulfill their function. Most of the cellular organelles are surrounded by
membranes in order to prevent uncontrolled mixing of their content w ith the cytoplasm. Communication
betw een the organelles is mediated by vesicles that travel betw een different compartments. We investigate
the regulation of membrane and protein traffic in different organisms. In the baker’s yeast Saccharomyces
cerevisiae, w e focus on the life cycle of a transport vesicle that is formed at the Golgi apparatus destined for
the endoplasmic reticulum. In contrast, in the nematode Caenorhabditis elegans, w e study membrane delivery
into the division plane during cytokinesis. Cytokinesis is the last step in cell division: After DNA has been
equally duplicated and distributed onto tw o poles, new membrane is inserted in betw een the poles at the
plasma membrane w hich divides the cellular content, resulting in tw o cells.
Transportvesikel befördern lösliche und Membran-Proteine zw ischen den verschiedenen, für die Sekretion
w ichtigen Kompartimenten in der eukaryotischen Zelle. Um ein Transportvesikel herzustellen, binden
Hüllproteine (coat-Proteine) an die Donormembran und deformieren die Membran derart, dass sich eine
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Hüllproteine (coat-Proteine) an die Donormembran und deformieren die Membran derart, dass sich eine
Knospe bildet. Die zu transportierenden Proteine (Cargo) w erden dann spezifisch in die entstehenden Vesikel
aufgenommen. Anschließend trennen sich die Vesikel von der Donormembran und bew egen sich eine
bestimmte Entfernung, bis sie mit der Akzeptororganelle verschmelzen.
Zum Zeitpunkt der Knospung der Vesikel müssen drei Voraussetzungen erfüllt sein, damit sich ein funktionelles
Vesikel bilden kann (Abb. 1): 1) Die verschiedenen intrazellulären vesikulären Transportsysteme benutzen
verschiedene Hüllproteine. Daher muss sichergestellt w erden, dass die richtigen cytosolischen Hüllproteine an
die
Donormembran
binden.
2)
Die
Transportvesikel
müssen
bestimmte
Membranproteine
bzw .
Transportfaktoren beinhalten, die für einen späteren Schritt (z. B. die Vesikelfusion) essenziell sind. Diese
Proteine müssen mit großer Sicherheit in die Vesikel rekrutiert w erden. 3) Cargo-Proteine müssen erkannt und
in die knospenden Vesikel einverleibt w erden.
W ie bilden sich die Vesikelhüllen auf der Donormembran? Beeinflussen Transportfaktoren und Cargo diesen
Prozess? Diese und w eitere Fragen versuchen w ir zurzeit zu beantw orten.
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Unse r a k tue lle s Mode ll, wie Ve sik e lbildung a m cis-Golgi
a bla ufe n k önnte . Im e rste n Schritt wird die k le ine GTP a se
Arf1p (rote s O va l) m itte ls de s AR F-spe zifische n Gua ninNuk le otid Austa uschfa k tors (GEF, grüne s O va l) a n die GolgiMe m bra n re k rutie rt. Da be i finde t die Ak tivie rung de r k le ine n
GTP a se sta tt, we il durch da s GEF da s im ina k tive n Zusta nd
ge bunde ne GDP durch GTP e rse tzt wurde . Zur gle iche n Ze it
induzie rt e in AR F-GTP a se a k tivie re nde s P rote in (AR F-GAP ,
bra une s O va l) e ine Konform a tionsä nde rung in SNAR E
P rote ine n (bla ue R e chte ck e ), um so die Aufna hm e in C O P I
Ve sik e l zu e rm ögliche n. Im zwe ite n Schritt inte ra gie rt da s
a k tivie rte Arf1p m it de n SNAR Es, wä hre nd de r
Hüllprote ink om ple x C oa tom e r (silbrige r Ba lk e n) und da s AR FGAP unte rschie dliche Fra cht (bra une s R e chte ck , golde ne r
Ste rn, grüne s Dre ie ck ) zur Knospungste lle bringe n, da m it sie
in Ve sik e l a ufge nom m e n we rde n. Fra cht, die sich im Inne rn
de s O rga ne lls be finde t, wird m it Hilfe e ine s C a rgo-R e ze ptors
(bra une s R e chte ck m it bla ue m O va l) tra nsportie rt. Die
Knospungste lle für da s ne ue Ve sik e l wird durch die SNAR Es,
Arf1p, AR F-GAP und C oa tom e r ge bilde t. Durch da s
Eindiffundie re n de r Fra cht-Hüllprote in Kom ple x e k önne n die
Hüllprote ine la te ra l polym e risie re n. Die se P olym e risa tion führt
zur Krüm m ung de r Me m bra n, die da nn schlie ßlich zur Bildung
e ine r Knospe und na ch de re n Abschnürung zu e ine m
Tra nsportve sik e l führt. Da s be de ute t, da ss de n SNAR E
P rote ine n, wie a uch de r Fra cht, e ine re gula torische R olle in de r
Ve sik e lbildung zuk om m t. P rote ine , die stä ndig im Golgi
Appa ra t sind, k önne n nicht in die Knospungste lle diffundie re n,
sie we rde n im Golgi Appa rt zurück ge ha lte n (be ige s O va l).
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Regulation der Vesikelbildung und beteiligte Schlüsselproteine
Vesikel, die in frühe Transportschritte (z.B. zw ischen ER und Golgi-Apparat) involviert sind, haben entw eder
einen COPI oder COPII coat (COP steht für coat protomer). Die COPI-Hülle besteht aus einem heptameren
Proteinkomplex (α-, β-, β'-, ∂-, ε-, γ-, ζ-coat) von etw a 700 kDa und der kleinen GTPase Arf1p. Zu den COPIIKomponenten zählen zw ei Heterodimere (der Sec23/24- und der Sec13/31-Komplex) sow ie die kleine GTPase
Sar1p. W ährend die COPI- und die COPII- Hülle für den anterograden Transport (Vorw ärtstransport vom ER
zum und durch den Golgi-Apparat) gebraucht w erden, hängt der retrograde Transport (Rücktransport vom
Golgi-Apparat zum ER) nur von den COPI-Hüllproteinen ab.
Um die Regulation der Knospung von Transportvesikeln besser zu verstehen, versuchen w ir die verschiedenen
Schritte, die zu einem Vesikel führen, in vitro nachzustellen. So w urde bereits gezeigt, dass Vesikel durch
Inkubation von synthetischen, chemisch-definierten Liposomen mit gereinigten COPI-Hüllproteinen, der kleinen
GTPase Arf1p und Nukleotiden gebildet w erden konnten [1]. Diese artifiziellen Vesikel hatten die gleiche Größe
w ie die natürlichen Vesikel, w as bedeutet, dass die Hüllproteine für die Größe der Vesikel verantw ortlich sind.
Obw ohl diese künstlichen Transportcontainer ohne Cargo oder andere Membranproteine entstanden sind,
bedeutet dies nicht, dass auch in vivo „leere“ Vesikel vorkommen. Daher w ollen w ir als Nächstes zeigen, dass
Transportfaktoren, die für die Verschmelzung des Vesikels mit der Akzeptormembran benötigt w erden, in
Vesikel eingeschlossen w erden, indem sie die Kospungsstelle markieren. So führt die Erhöhung der
Bindestellen für Hüllproteine zu einer vermehrten Vesikelbildung [2].
Eine w eitere Stufe der Regulation bietet die Aktivierung und Rekrutierung der kleinen GTPase Arf1p zur
Donormembran. Dieser Prozess w ird durch einen so genannten Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF)
gesteuert. Außerdem benötigt Arf1p ein w eiteres Protein zur Stimulierung der Aktivität, ein so genanntes
GTPase aktivierendes Protein (ARF-GAP). W ir untersuchen, w ie die beiden Regulatorproteine selber gesteuert
w erden, um zu einem besseren Verständnis des räumlichen und zeitlichen Ablaufs der Knospung von Vesikeln
zu gelangen. W ir konnten zeigen, dass ARF-GAP nicht nur w ichtig für die Stimulierung der GTPase-Aktivität von
Arf1p ist, sondern auch bei der Knospung von Vesikeln und der Aufnahme von Transportfaktoren eine
essentielle Rolle spielt [3, 4]. Arf1p hat viele Funktionen in der Zelle, und es sind natürlich auch
Regulatorproteine w ie GEFs und GAPs bekannt. Allerdings reichen die bekannten, interagierenden Proteine
nicht aus, um die zeitliche und räumliche Regulation zu erklären. Daher haben w ir auf biochemischem Weg
neue Interaktoren gesucht. Die Charakterisierung dieser neuen Arf1p interagierenden Moleküle w ird uns noch
eine Weile beschäftigen. Bisher konnten w ir für Arf1p und die COPI-Vesikel eine Rolle im mRNA Transport in der
Zelle nachw eisen [5]. Das Ausmaß dieser Beobachtung w ird in unserer Arbeitsgruppe w eiter untersucht.
W ir determinieren nicht nur die direkte Interaktion zw ischen verschiedenen, am Transport beteiligter Proteine,
sondern stellen auch den Vorgang des retrograden Transports vom Golgi zurück in das endoplasmatische
Retikulum im Reagenzgefäß nach [6]. Dieser Transportassay erlaubt uns, komplexe Interaktionen und
Regulationsmechanismen im Einzelnen zu untersuchen. W ir konnten z.B. kürzlich zeigen, dass es einen bislang
unbekannten Mechanismus gibt, der verhindert, dass ein Vesikel mit der Membran desjenigen Kompartiments
verschmilzt, von dem es gebildet w urde [7].
Experimente mit Caenorhabditis elegans
Des Weiteren untersuchen w ir in der Arbeitsgruppe die Fusion von Transportvesikeln mit Akzeptormembranen,
sow ohl im retrograden Transport vom Golgi zum ER als auch bei der Zellteilung w ährend der Cytokinese. Für
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das letztere Projekt benutzen w ir den Nematoden Caenorhabditis elegans als Modellorganismus. Um diese
Untersuchungen durchführen zu können, stellen w ir transgene W ürmer her, die jew eils ein GFP-Fusionsprotein
exprimieren, das spezifisch für ein Organell in der Zelle ist (GFP: green fluorescent protein). Der erste
transgene W urm exprimiert ein ER-residentes, GFP-markiertes Protein in seinen Eizellen ([8] und Abb. 2).
Somit w ird in unserer Arbeitsgruppe der komplette „Lebenszyklus“ eines Vesikels von der Enstehung bis zur
Verschmelzung mit der Zielmembran erforscht.
Aufna hm e von dre i Eize lle n von C a e norha bdidtis e le ga ns in
ute ro. Da s ER ist m it e ine m ER -re side nte n GFP -Fusionsprote in
m a rk ie rt. Die dre i Eize lle n ste lle n unte rschie dliche
Entwick lungsta die n da r: Unte re s Ei: na ch de r Ve rschm e lzung
von m a te rna le m und pa te rna le m Ke rn; m ittle re s Ei: die
Mitose de s e rste n Ze llzyk lus; obe re s Ei: be ginne nde Mitose
de r be ide n Ze lle n de s Em bryos.
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[1] A. Spang, K. Matsuoka, S. Hamamoto, R. Schekman, L. Orci:
Coatomer, Arf1p, and nucleotides are required to bud coat protein complex I-coated vesicles from large
synthetic liposomes.
Proc Natl Acad Sci U S A 95, 11199-11204 (1998)
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Arf1p provides an unexpected link between COPI vesicles and mRNA in Saccharom y ces cerev isiae.
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