Diss. ETH No. 22592 Characterization of the surface microbiota of smear-ripened cheese and its role in the development of a smear defect after vacuum film-prepackaging A dissertation submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by JASMINE SILVANA RITSCHARD MSc of Science ETH in Biology born on 26.07.1985 citizen of Oberhofen am Thunersee BE, Switzerland accepted on the recommendation of Prof. Dr. Martin J. Loessner, examiner Dr. Markus Schuppler, co-examiner Prof. Dr. Leo Meile, co-examiner 2015 Summary The varieties of surface-ripened red-smear cheese have a long tradition in Europe and are characterized by the development of an orange-red pigmented smear layer on top, composed of a multi microbial species ecosystem. The smear microbiota inhabited by yeast and typical red smear bacteria develops in a successive manner during cheese ripening and contributes to the appearance, organoleptic and textural properties of this type of cheese. A stable smear microbiota protects from the growth of microbial contaminants or the desiccation of cheese and thus impacts its shelf-life. As the world economy globalizes exports continue to grow and consumer’s demands for vacuum film-prepacked cheese portions purchased from self-service shelves are increasing. However, the vacuum film-prepackaging of semi-hard smear-ripened cheese is often accompanied by undesired changes of the olfactory characteristics and consistency of the cheese surface smear, what leads to complaints by consumers, results in a decline in sales and causes a financial impact for the cheese industry. Due to the lack of scientific knowledge, the development of the smear defect during vacuum film-prepacked cheese storage is not predictable, nor are preventive measures available maintaining a high smear quality under vacuum film-prepackaging. The exclusion of oxygen through filmprepackaging was hypothesized to favor the growth of facultative and strictly anaerobic microorganisms and/or change the metabolic activity of certain smear microorganisms. This thesis intended to study the surface microbiota involved in the smear defect development upon film-prepackaging of semi-hard smear-ripened cheese for the elucidation of the reason for the smear defect development and to investigate and evaluate alternative cheese packaging solutions. By application of traditional culture-based methods and culture-independent molecular community fingerprinting techniques such as Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP) analysis the microbial composition of 47 smear samples differing in quality was comparatively analyzed. Subsequently, potential compositional alterations in the smear microbiota, induced by vacuum filmprepackaged cheese storage, were monitored for three representative samples by an advanced 16S rDNA and 16S rRNA high-throughput sequencing technology. The cheese surface smear microbiota turned out to be unexpectedly diverse as it harbored the genetic and ribosomal imprint of at least 132 different bacterial genera whereof particular smear microorganisms were cultivable. The 16S rRNA based high-throughput sequencing analysis revealed a majority of aerobic members of Actinobacteria, such as Corynebacterium, Brevibacterium, Brachybacterium and Agrococcus to feature the highest metabolic activity on the surface of unpacked or vacuum film-prepacked cheese samples during the storage period. The changed atmospheric conditions to anaerobiosis by vacuum filmprepackaging had an impact on the microbial metabolic activity of certain microorganisms as indicated by the prevalence of 16S rRNA reads from anaerobic and strict anaerobic bacteria which were exclusively detected in smear samples of vacuum film-prepacked cheeses. Beside typical smear bacteria, the culture-based and molecular analysis revealed a variety of unexpected bacterial taxa, even the first description of certain bacteria in the cheese ecosystem (inter alia Clavibacter, Frigoribacterium or Salirhabdus). Proteobacteria, mainly Enterobacteriaceae of the genus Proteus and Morganella, were found to colonize also the surface of twelve additionally investigated semi-hard red-smear cheese varieties. The identification of volatiles in the cheese surface headspace suggested that Enterobacteriaceae contribute to the production of volatile compounds relevant for cheese flavor and must not entirely be considered as undesired contaminants. As several genera show the potential to contribute to smear defects by off-flavor or exopolysaccharide production, they were hypothesized in literature to be involved in the smear defect development. However, this hypothesis could not be confirmed by the results from this study, as the smear defect could not be assigned to an individual microbial group, nor all of the defect smear samples were colonized by the presumed defect contributors. Furthermore, the cultivated microbiota, as well as the molecular microbial community patterns strongly resembled each other, independent of the cheese smear quality or the storage of cheese unpacked or in vacuum film-prepackaging. The monitoring of the cheese surface microbiota revealed a decrease of 1 log unit of total mesophilic bacterial colony counts during 8 weeks refrigerated storage which presumably resulted in the release of bacterial cytoplasmic enzymes due to cell death, thus promoting an enhanced proteolysis in the smear of vacuum film-prepacked cheese. This might have contributed to the accumulation of volatile flavor compounds under the plastic film escaping as aroma flush upon opening a defect vacuum filmprepacked cheese portion. Furthermore, the smear defect development seems to be accompanied by water diffusion from the cheese interior to the cheese surface, leading to an accumulation of water in the interspace between cheese surface and the packaging. In summary, the results from this study point to a complex etiology, where more than a single microbial and physico-chemical factor contributes to the smear defect development. The application of a polyvinyl acetate (PVA) coating as an alternative packaging solution for vacuum film-prepackaging retained the high cheese surface quality for at least 6 to 12 weeks storage. Mainly the water vapor permeability of the coating material resulting in a water activity decrease, as well as the diminished anaerobic atmosphere surrounding the cheese surface, in combination with a slighter decrease in colony counts, allowed the prolonged retention of the high smear quality. In conclusion, studying the cheese surface microbiota involved in the smear defect development, this thesis constitutes the complex etiology of the smear defect. It demonstrates that profound knowledge about the microbial surface smear ecosystem and its environmental conditions are crucial for the prevention of cheese quality defects and for an improved understanding of the microbiology of surface-ripened red-smear cheese. Zusammenfassung Oberflächengereifte Rotschmierekäse haben eine lange Tradition in Europa und zeichnen sich aus durch die Bildung einer orange-rot gefärbten Schmiere auf der Oberfläche. Diese Schmiere beherbergt ein natürliches mikrobielles Ökosystem, welches sich aus Hefen und Rotschmierebakterien zusammensetzt. Die Entwicklung der Oberflächenmikroflora ist gekennzeichnet durch eine mikrobielle Sukzession während der Käsereifung. Sie beeinflusst die Erscheinung, sowie organoleptische und strukturelle Eigenschaften des Käses. Eine stabile Oberflächenmikroflora schützt den Käse vor einer Besiedelung mit Verderbnisund Krankheitserregern und vor dem Austrocknen und beeinflusst dadurch seine Haltbarkeit. Mit der ökonomischen Globalisierung steigen die Käseexporte wie auch die Nachfrage nach vakuum-folienverpackten Käseportionen, welche von den Konsumenten direkt aus der Selbstbedienungsauslage erworben werden können. Die vakuum-folienverpackte Lagerung von oberflächengereiftem Halbhart-Käse geht jedoch oft einher mit einer unerwünschten Veränderung der Beschaffenheit wie auch der Geruchskomponenten der Käseschmiere. Dies führt zu Kundenreklamationen, Auslistungen, Rückgang des Verkaufes und demzufolge zu bedeutenden finanziellen Verlusten für die Käseindustrie. Bisher waren keine wissenschaftlichen Erkenntnisse vorhanden, welche es erlaubten die Entwicklung des Defektes vorherzusagen, noch waren präventive Massnahmen zur Erhaltung einer gesunden Schmiere während der gekühlten Lagerung verpackter Käse vorhanden. Es wurde vermutet, dass der Ausschluss von Sauerstoff in der Verpackung das Wachstum von fakultativ oder strikt anaeroben Mikroorganismen fördert, oder die metabolische Aktivität der typischerweise unter aeroben Bedingungen wachsenden Schmieremikroorganismen beeinflusst. Die vorliegende Dissertation hatte das Ziel die Oberflächenmikrobiota der defekten Schmiere zu studieren, welche sich auf oberflächengereiften Halbhart- Käsen während der vakuum-folienverpackten Lagerung entwickelt. Weiter sollten entsprechende Gegenmassnahmen, wie beispielsweise alternative Verpackungslösungen, erforscht und evaluiert werden. Mittels traditionellen kulturbasierten und kulturunabhängigen molekularen „Community Fingerprinting“ Techniken, wie der Terminalen Restriktions Fragmentlängen Polymorphismus (TRFLP) Analyse, wurde die mikrobielle Zusammensetzung von 47 Schmiereproben unterschiedlicher Qualität verglichen. Zusätzlich wurden mögliche Veränderungen in der mikrobiellen Zusammensetzung, verursacht durch die vakuum-folienverpackte Lagerung, bei drei repräsentativen Schmiereproben mittels moderner 16S rDNA und 16S rRNA HochdurchsatzSequenzierung analysiert. Dies erlaubte eine vertiefte und detaillierte Einsicht in die Zusammensetzung des mikrobiellen Ökosystems der Oberflächenschmiere und der metabolischen Aktivität der vorhandenen Schmieremikroorganismen. Die Oberflächenmikrobiota erwies sich als erstaunlich divers, was sich im molekularen Nachweis von mindestens 132 verschiedenen bakteriellen Genera zeigte. Die 16S rRNA basierte Hochdurchsatz-Sequenzierung zeigte, dass insbesondere Vertreter der Actinobacteria, wie Corynebacterium, Brevibacterium, Brachybacterium und Agrococcus während der unverpackten oder vakuumfolienverpackten Käselagerung metabolisch sehr aktiv sind. Die geänderte Atmosphäre in der Vakuum-Folienverpackung zu anaeroben Bedingungen, scheint die metabolische Aktivität der vorhandenen Bakterien deutlich zu beeinflussen. So wurden 16S rRNA Sequenzen von anaeroben Bakterien nur in Schmiereproben von vakuum-folienverpackten Käsen detektiert. Neben typischen Schmierebakterien wurden auch solche Bakterien detektiert, deren Vorkommen im Ökosystem Käse hier zum ersten Mal beschrieben wird (u.a. Clavibacter, Frigoribacterium oder Salirhabdus). Die mikrobielle kulturbasierte Analyse von zwölf weiteren oberflächengereiften Halbhart-Käsesorten bestätigte, dass solche Käse häufig mit Proteobacteria, insbesondere Vertreter der Enterobacteriaceae wie Proteus und Morganella besiedelt sind. Die Identifizierung von volatilen Geruchskomponenten im Kopfraum über der Käseoberfläche lässt vermuten, dass Vertreter der Enterobacteriaceae durch ihre enzymatische Aktivität zum charakteristischen Aroma von Schmierekäse beitragen und daher nicht grundsätzlich als unerwünschte Kontaminanten zu erachten sind. In der Literatur Mikroorganismen diskutiert, da werden präsumtiv sie das verschiedene als Potential mögliche zur für Käseschmiere Verursacher Bildung von von untypische Käsefehlern Fehl-Aromen oder Exopolysacchariden aufweisen. Allerdings konnte diese Hypothese in dieser Arbeit nicht bestätigt werden, da der Käsefehler nicht mit dem Auftreten oder verstärkten Vorkommen einer bestimmten mikrobiellen Gruppe in Verbindung gebracht werden konnte. Zudem zeigte sowohl die kulturbasierte, wie auch die molekulare Analyse, dass sich die mikrobielle Zusammensetzung in den Schmiereproben stark ähnelt, unabhängig von der Schmierequalität oder der Art der Lagerung als unverpackte oder vakuum-folienverpackte Käseportion. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die erhöhte Freisetzung von bakteriellen cytoplasmatischen Enzymen, aufgrund des vermehrten Absterbens von Zellen unter vakuum-folienverpackter Lagerung zu einer verstärkten Proteolyse in der Käseschmiere führt. Die dadurch verstärkt produzierten volatilen Geruchskomponenten akkumulieren sich unter der Folienverpackung und entweichen als intensiver Geruchsschwall bei Öffnung der Verpackung. Zusätzlich geht mit der Entwicklung des Käsefehlers eine Diffusion von Wasser aus dem Käseinneren an die Oberfläche einher, bei der sich die Feuchtigkeit anschliessend unter der Folie ansammelt, da diese als Barriere für Sauerstoff und Wasserdampf fungiert. Zusammengefasst zeigt sich eine hochkomplexe Ätiologie bei welcher mehr als ein einzelner mikrobieller oder physikalisch-chemischer Faktor zur Defektentwicklung der Schmiere von halbhartem Rotschmierekäse beiträgt. Bei der Evaluation alternativer Verpackungsstrategien erwies sich die Verwendung eines Polyvinyl Acetate (PVA) Coatings als probable Lösung, um während mindestens 6 bis 12 Wochen gekühlter Lagerung eine gesunde Käseschmiere zu erhalten. Dies wurde insbesondere begünstigt durch eine Kombination von veränderten Eigenschaften des Coatings, wie der Permeabilität für Wasserdampf und Sauerstoff, welche zu einer Senkung der Wasseraktivität führt, sowie eines etwas höheren Sauerstoffpartialdrucks, was zu einer geringeren Abnahme der Gesamtkeimzahl führte. Diese Verpackungslösung zeichnet sich dadurch aus, dass Feuchtigkeit und volatile Geruchskomponenten gemässigt entweichen können und gleichzeitig ein zu hoher Eintrag von Sauerstoff verhindert wird. Die Ergebnisse der hier vorgestellten Dissertation, welche zur Erforschung der Ursache für den beobachteten Schmieredefekt das mikrobielle Ökosystem der Oberflächenschmiere untersuchte, zeigen die hochkomplexe Ätiologie dieses Käsefehlers auf und verdeutlichen die Bedeutung der Erforschung solcher lebensmittelassoziierter Umweltbedingungen mikrobieller für das Ökosysteme tiefere oberflächengereifter Rotschmierekäse. und Verständnis der der zugehörigen Mikrobiologie
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