Squish PCR: Zeitsparende Methode zur Genotypisierung von

Squish PCR:
Zeitsparende Methode zur Genotypisierung von
Drosophila Stämmen
Einleitung:
Drosophila melanogaster hat sich als Modellorganismus in der Entwicklungsbiologie
und der Genetik bewährt, und findet heute auch als Modell für menschliche
Krankheiten in der präklinischen Forschung Anwendung. Die kurze Generationszeit,
die verhältnismäßig leichte Haltung und die große Anzahl von produzierten
Nachkommen erleichtern die Haltung von Drosophila in der wissenschaftlichen
Forschung. Drosophila besitzt vier Chromosomenpaare: die Geschlechtschromosomen (X/X- bzw. X/Y) und die Autosomen 2, 3 und 4. Das gesamte Genom
ist etwa 140 Millionen Basen groß und enthält rund 17.700 Gene (FB2015_02 release
of FlyBase).
Einer der größten Vorteile von Drosophila als Modellorganismus ist jedoch seine
leichte genetische Manipulierbarkeit, was die Generation mutanter Allele von
Fliegengenen, die Einführung zusätzlichen genetischen Materials (Transgene) und
ihre Kombination durch chromosomale Rekombination umfasst (Ashburner et al.,
2005). Die Häufigkeit chromosomaler Rekombinationen ist proportional zu der Distanz
zwischen den beiden genomischen Loci. Daher erfordert es die Testung einer großen
Anzahl von Tieren um ein Individuum zu identifizieren, bei dem chromosomales
Crossover zwischen zwei nah beieinander gelegenen Loci stattgefunden hat.
Abbildung 1: Unterscheidung des Geschlechts bei Drosophila melanogaster.
Die letzten beiden Hinterleibsegmente der Männchen sind dunkel gefärbt und auf der Vorderseite
verfügt das Männchen über einen Genitalbogen mit Penis. Männchen tragen zudem an den
Vorderbeinen eine als Geschlechtskamm bezeichnete dunkle Borstenreihe. Weibchen sind im
Durchschnitt geringfügig größer als Männchen, ihr Hinterleib läuft spitz zu und alle Hinterleibsegmente
sing gleichmäßig gebändert. Weibchen weisen auf Ihrer Vorderseite eine strukturell unauffällige
Vaginalplatte auf. Abbildungen modifiziert nach: Flymove; Childress, Behringer und Halder.
1
Die genomische DNA einer Fliege kann mittels
“Squish single fly” Protokoll (Gloor et al., 1993)
schnell und unkompliziert isoliert werden. Die
genomische DNA muss dabei nicht gesondert
aufgereinigt werden, sondern kann direkt für
die
Amplifikation
mittels
PolymeraseKettenreaktion (polymerase chain reaction,
PCR) eingesetzt werden. Diese einfache
Methode erlaubt es eine große Anzahl von
Individuen mit wenig Zeitaufwand auf einen
bestimmten Genotyp hin zu testen.
Die PCR ist eine Methode zum Nachweis und
zur enzymatischen Vermehrung kleinster
Mengen spezifischer DNA zwischen zwei
Nukleotid-Primern. Eine PCR besteht aus 2040 Zyklen. Jeder Zyklus umfasst die folgenden
drei Schritte: Die zu amplifizierende DNA wird
in
Einzelstränge
aufgeschmolzen
(1.
Denaturierung), die Primer binden gegenläufig
an die DNA-Stränge (2. Hybridisierung) und
die DNA-Polymerase heftet Nukleotide an die
3‘-OH
Primer-Enden
und
synthetisiert
komplementäre DNA-Sequenzen (3. DNASynthese).
Man
spricht
von
einer
Kettenreaktion,
da
die
entstandenen
Synthese-produkte eines jeden Zyklus als
DNA-Matrize für den nächsten Zyklus dienen
und
es
somit
zur
exponentiellen
Vervielfältigung der DNA-Doppelstränge mit
jedem Zyklus kommt (Knippers, 2006).
Versuchsablauf:
In diesem Experiment nutzen wir die Squish PCR um drei unbekannte Stämme auf
Veränderungen im Genlokus des atf3 Gens (z.B. Insertionen, Deletionen, Inversionen)
zu analysieren.
2
Erste Versuchswoche:
1. Stellen Sie den Squish Extraktionspuffer (SE) in einem 1.5 ml Reaktionsgefäß her:
200 µl
Squish Puffer (SP) [10 mM Tris-HCl pH 8.2, 1 mM EDTA pH 8, 25 mM
NaCl]
4 µl
Proteinase K (PK) [20 mg/ml stock)
Vortexen Sie die Lösung, zentrifugieren Sie kurz runter und stellen Sie
anschließend auf Eis kalt.
2. Markieren Sie drei PCR-Reaktionsgefäße mit der entsprechenden Stock-Nr. und
Ihrer Gruppennummer und stellen Sie sie auf Eis kalt.
3. Die Fliegenstämme wurden zuvor durch einstündige Inkubation bei -20°C
eingeschläfert. Überführen Sie die Fliegen des ersten Stammes auf die
bereitgestellte Petrischale und identifizieren Sie unter dem Binokular unter zu
Hilfenahme von Abbildung 1 ein einzelnes Weibchen.
4. Überführen Sie das Weibchen mit Hilfe einer Pinzette in das entsprechende PCRReaktionsgefäß.
5. Entsorgen Sie die restlichen Fliegen aus der Petrischale in dem dafür
vorgesehenen Autoklavierabfall.
6. Verfahren Sie gleichermaßen mit den beiden anderen Stämmen.
7. Nehmen Sie 50 µl des vorbereiteten SE mit der Pipette in eine gelbe Spitze auf.
Zerdrücken Sie die Fliege in dem PCR Reaktionsgefäß mit Hilfe der gelben Spitze
ohne die Flüssigkeit auszuwerfen. Erst wenn die Fliege deutlich aufgeschlossen
wurde, werfen Sie die Flüssigkeit aus und vermischen sie mit dem Fliegenextrakt.
8. Gleichermaßen verfahren Sie mit den zwei weiteren Proben.
9. Zentrifugieren Sie die Proben kurz, stellen sie in die vorbereitete PCR Maschine
und laufen Sie folgendes Programm nachdem alle Gruppen ihre Proben in dem
Gerät platziert haben:
„Squish“ Programm
 55oC für 30 min

95oC für 5 min

4oC
3
10.
Stellen Sie den Mastermix für die PCR wie folgt her:
Master Mix PCR
Reagenzien
Volumen [µl]
steriles ddH2O
17
2x ExTaq PCR mix
25
dNTPs
4
Primer 1 (P1)
2
Primer 2 (P2)
2
Gesamtvolumen
50
Tabelle 1: Primer
Primer Name
Nr.
1
Deletion Atf3 For
2
Brian rev
11.
Sequenz
GACAAATGGACAAATGGACAAACGG
TGGGATGGTTGCTGGCACTGCCAGTT
Mischen Sie den Master Mix durch vortexen und zentrifugieren ihn
anschließend kurz um die Flüssigkeit am Boden des Reaktionsgefäßes zu
sammeln.
12.
Kennzeichnen Sie einen PCR-Streifen auf der Seite des Gefäßes wie folgt:
1
2
2
4
N-1
N-2
N-3
N-NK
N: Gruppennummer; NK: Negativ Kontrolle
13.
Pipettieren Sie jeweils 11 µl des Mastermixes in jedes gekennzeichnete
Gefäß des Streifens.
14.
Pipettieren Sie 2 µl des Fliegenextraktes in die jeweilige PCR-Reaktion
(entsprechend dem Schema: Fliegenextrakt von Stamm 1 in das
Reaktionsgefäß N-1, 2 in Reaktionsgefäß N-2, usw.).
15.
Pipettieren Sie 2 µl steriles ddH2O in die Negativkontrolle (NK).
16.
Zentrifugieren Sie den PCR-Streifen kurz, stellen Sie ihn in die vorbereitete
PCR Maschine und laufen Sie folgendes Programm nachdem alle Gruppen
ihre Proben in dem Gerät platziert haben:
4
“atf3 PCR” Programm
1.
95 °C für 5 min,
2.
95 °C für 30 sec
3.
62 °C für 30 sec
4.
72 °C für 2 min 30 sec, wiederhole Schritt 2. – 4. 29x
5.
8 °C/end
Zweite Versuchswoche
17.
Stellen Sie ein ein-prozentiges Agarosegel wie folgt her:
0.5 g Agarose
50 ml 1xTAE
18.
Kochen Sie die Lösung in der Mikrowelle kurz auf bis sich die Agarose
vollständig gelöst hat (VORSICHT! Beim Erhitzen der Lösung kann es zum
Siedeverzug kommen! Deswegen: Flüssigkeit zwischendurch gelegentlich
umschwenken und nach dem Erhitzen die Flüssigkeit noch mind. 20 sec im
Gerät stehen lassen!))
19.
Lassen Sie die Lösung kurz abkühlen. Bauen Sie währenddessen die Kammer
zum Gießen des Gels zusammen.
20.
Fügen Sie unter Aufsicht eines Tischassistenten 2 µl Ethidiumbromid zu der
Agaroselösung (ACHTUNG: Ethidiumbromid ist gifitig und mutagen! Auf
jeden Fall Nitril-Handschuhe tragen! Kontakt vermeiden!), mischen Sie die
Lösung durch vorsichtiges schwenken und gießen sie vorsichtig in die
vorbereitete Gießapparatur.
21.
Fügen Sie 2 µl Ladepuffer (LP) zu jeder PCR-Reaktion hinzu und zentrifugieren
Sie erneut runter.
22.
Transferieren Sie das erhärtete Agarosegel in die Gelkammer und bedecken
Sie es großzügig mit 1xTAE Puffer.
23.
Laden Sie 10 µl jeder Ihrer PCR Proben auf dem Agarosegel sowie 4 µl DNALeiter (1 kb) entsprechend folgendem Schema:
Ladeschema Agarosegel:
1
2
2
4
5
1 kb
N1
N2
N3
N NK
5
24.
Lassen Sie das Gel bei 80V 40 min laufen und analysieren Sie die Banden
anschließend mit Hilfe der Geldokumentation.
25.
In der Zwischenzeit nutzen Sie die auf Ihren Computern installierte ApE
Software um herauszufinden wo im atf3 Genlokus die für die PCR verwendeten
Primer binden und wie groß das zu erwartende PCR-Produkt ist (Datei mit dem
atf3 Genlokus finden Sie auf dem Desktop).
Tabelle 2: Squish-PCR Ergebnisse
Stamm PCR-Fragmentgröße Genotyp
1
2
3
Referenzen
Ashburner,M., Golic K.G., and Hawley,R.S. (2005). Drosophila - A laboratory
handbook. (New York: Cold Spring Harbor).
Carvalho,G.B., Ja,W.W., and Benzer,S. (2009). Non-lethal PCR genotyping of single
Drosophila. Biotechniques 46, 312-314.
Gloor,G.B., Preston,C.R., Johnson-Schlitz,D.M., Nassif,N.A., Phillis,R.W.,
Benz,W.K., Robertson,H.M., and Engels,W.R. (1993). Type I repressors of P
element mobility. Genetics 135, 81-95.
Knippers, R., 2006, Molekulare Genetik , Stuttgart, Thieme.
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