Direkte Xa-Inhibitoren

BIOPHEN® DiXa-I
(Direkte Xa-Inhibitoren)
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Art.Nr. 221030
Chromogene Methode zur Bestimmung von
direkten Faktor Xa-Inhibitoren (DiXa-I)
In vitro-Diagnostikum
Version: 12/10/2015
VERWENDUNGSZWECK:
BIOPHEN® DiXa-I ist ein chromogener Test zur quantitativen Bestimmung der direkten Faktor XaInhibitoren (DiXa-I) wie Rivaroxaban (Xarelto®), Apixaban (Eliquis®) oder Edoxaban, in humanem
Citratplasma (oder gereinigten Präparationen) mit automatisierten oder manuellen Methoden. Die
Methode ist nicht geeignet zur Bestimmung indirekter Inhibitoren wie Fondaparinux oder Heparin.
ZUSAMMENFASSUNG:
Die Bestimmung der DiXa-I-Spiegel im Patientenplasma erlaubt die Überwachung der Therapie mit
DiXa-I und eine Anpassung der Dosierung.
TESTPRINZIP:
BIOPHEN® DiXa-I ist eine 2-Stufen-Methode, die auf der Hemmung einer konstanten Menge an
zugesetztem Faktor Xa (FXa) durch den zu testenden DiXa-I in der Probe und anschließender
Spaltung eines FXa-spezifischen chromogenen Substrates durch den restlichen FXa basiert. Dabei
wird der Farbstoff para-Nitroanilin (pNA) aus dem chromogenen Substrat freigesetzt. Die Menge des
freigesetzten pNA korreliert mit der FXa-Restaktivität. Die Farbentwicklung, gemessen bei 405 nm, ist
damit umgekehrt proportional zur DiXa-I Konzentration in der Probe.
[DiXa-I] + [FXa (Überschuss)]  [FXaDiXa-I] + [FXa (Rest)]
[FXa (Rest)] + Substrat  Peptid + pNA
IM KIT ENTHALTENE REAGENZIEN:
R1: Reagenz 1: Humaner Faktor Xa
3 Flaschen gereinigter, humaner FXa, in Gegenwart von Stabilisatoren lyophilisiert.
R2: Reagenz 2: Faktor Xa-spezifisches chromogenes Substrat
3 Flaschen chromogenes FXa-Substrat CS-11(65), mit Mannitol, lyophilisiert.
R3: Reagenz 3: Tris-NaCl-EDTA-Puffer
4 Flaschen mit je 25 ml Tris-NaCl-EDTA-Puffer pH 7,85, enthält 1% PEG6000 und Natriumazid als
Konservierungsstoff, gebrauchsfertig. R3 enthält als Konservierungsmittel Natriumazid in geringer
Konzentration (0,9 g/l), der Warnhinweis unten ist zu beachten.
ANMERKUNGEN UND WARNHINWEISE:

Alle Produkte biologischen Ursprungs müssen mit den erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen und
als potentiell infektiös gehandhabt werden.

Natriumazid kann mit Blei- bzw. Kupferarmaturen unter Bildung hochexplosiver Metallazide
reagieren.

Faktor Xa wird aus humanem Plasma hergestellt, das mit registrierten Methoden getestet und als
negativ für HIV-Antikörper, HBs- Ag und HCV-Antikörper eingestuft wurde. Bovines
Serumalbumin (BSA) wurde aus bovinem Plasma hergestellt, das auf die Abwesenheit
infektiöser Substanzen getestet und aus BSE-freien Tieren hergestellt wurde. Kein Test kann
jedoch mit absoluter Sicherheit die Anwesenheit infektiöser Substanzen ausschließen. Wie alle
Produkte humanen Ursprungs muss diese FXa-Präparation daher mit allen
Vorsichtsmaßnahmen, die im Umgang mit potentiell infektiösem Material erforderlich sind,
gehandhabt werden.

Die FXa-Konzentration wird lotspezifisch angepasst, um die korrekte Reaktivität im Test zu
gewährleisten.

Nur Reagenzien aus Packungen mit identischer Chargennummer verwenden.

Falls das Substrat eine Gelbfärbung aufweist, ist dies ein Zeichen von Kontamination. Die
betroffene Flasche ist zu verwerfen und eine neue Flasche muss verwendet werden.

Die Flaschen von R1 und R2 werden unter Vakuum verschlossen. Die Verschlüsse sind
vorsichtig zu entfernen, um einen Verlust von Lyophilisat beim Öffnen zu vermeiden.

Bei hoch-lipämischen, -ikterischen oder –hämolytischen Plasmen sowie für Plasmen, deren
Färbung abweicht, sind Probenleerwerte zu messen.

Bei Entsorgung sind die lokalen Entsorgungsrichtlinien zu befolgen.

Die Reagenzien sind sorgfältig zu handhaben, um jegliche Kontamination während des
Gebrauchs zu vermeiden. Die Verdunstung ist während des Reagenzgebrauchs durch
Verringerung der Verdunstungsoberfläche so gering wie möglich halten.

Stabilitätsstudien für 3 Wochen bei 30°C haben gezeigt, dass die Packungen ohne
Beeinträchtigung der darin enthaltenen Reagenzien bei Raumtemperatur versendet werden
können.

Zur in-vitro-Diagnostik
VORBEREITUNG UND STABILITÄT DER REAGENZIEN:
R1: Reagenz 1: Humaner Faktor Xa
Den Inhalt jeder Flasche mit exakt 2,5 ml aqua dest. rekonstituieren und bis zur vollständigen
Homogenisierung gut schütteln. Für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (18-25°C) und dabei
gelegentlich schütteln. Den Inhalt vor jedem Gebrauch homogenisieren.
Stabilität des rekonstituierten Reagenz in der Originalflasche oder in einem geschlossenen
Plastikröhrchen unter Vermeidung jeglicher Kontamination und Verdunstung:
 15 Tage bei 2-8°C
 7 Tage bei Raumtemperatur (18-25°C).
 2 Monate bei ≤ -20°C*
HYPHEN BioMed
R2: Reagenz 2: Faktor Xa-spezifisches chromogenes Substrat
Den Inhalt jeder Flasche mit exakt 2,5 ml aqua dest. rekonstituieren und bis zur vollständigen
Auflösung des Inhalts gut schütteln. Für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (18-25°C) und
dabei gelegentlich schütteln. Den Inhalt vor jedem Gebrauch homogenisieren.
Stabilität des rekonstituierten Reagenz in der Originalflasche oder in einem geschlossenen
Plastikröhrchen unter Vermeidung jeglicher Kontamination und Verdunstung:
 2 Monate bei 2-8°C.
 7 Tage bei Raumtemperatur (18-25°C)
 2 Monate bei ≤ -20°C*
* Bei 37°C einmalig so schnell wie möglich auftauen, wobei die Dauer an die Plasmavolumina
anzupassen ist. Die Stabilität des aufgetauten Reagenz ist unter den Arbeitsbedingungen des
jeweiligen Labors zu prüfen.
R3: Reagenz 3: Tris-NaCl-EDTA-Puffer
Gebrauchsfertig. Den Inhalt vor jedem Gebrauch durchmischen.
Nach dem Öffnen ist das in der Originalflasche gelagerte Reagenz unter Vermeidung jeglicher
Kontamination und Verdunstung über folgende Zeiträume stabil:
 2 Monate bei 2-8°C
 7 Tage bei Raumtemperatur (18-25°C)
LAGERUNG:
Ungeöffnete Reagenzien müssen bei 2–8°C in der Originalverpackung gelagert werden und sind dann
bis zu dem auf der Verpackung aufgedruckten Verfalldatum stabil.
ERFORDERLICHE MATERIALIEN, DIE NICHT IM KIT ENTHALTEN SIND:
Reagenzien:
 aqua dest., vorzugsweise steril.
 20% Essigsäure oder 2% Zitronensäure (Endpunkt-Methode).
 Kalibrationsplasma, titriert für den zu bestimmenden DiXa-I, oder DiXa-I Referenzmaterial
(international oder intern), z.B.:
- BIOPHEN® Rivaroxaban Kalibrationsplasmen (Art.Nr. 222701), BIOPHEN® Rivaroxaban
Kalibrationsplasmen (Niedrig) (Art.Nr. 226001).
- BIOPHEN® Apixaban Kalibrationsplasmen (Art.Nr. 226201), BIOPHEN® Apixaban
Kalibrationsplasmen (Niedrig) (Art.Nr. 226101).
 Kontrollplasmen, titriert für den zu bestimmenden DiXa-I, z.B:
- BIOPHEN® Rivaroxaban Kontrollplasmen (Art.Nr. 224501), BIOPHEN® Rivaroxaban
Kontrollplasmen (Niedrig) (Art.Nr. 225101).
- BIOPHEN® Apixaban Kontrollplasmen (Art.Nr. 225301), BIOPHEN® Apixaban Kontrollplasmen
(Niedrig) (Art.Nr. 225201).
Geräte:
 Spektrophotometer oder Gerinnungsautomaten zur Bestimmung chromogener Teste.
 Stoppuhr.
 Geeichte Pipetten.
PROBENGEWINNUNG:
Die Gewinnung und Lagerung der Proben hat gemäß aktueller lokaler Vorschriften zu erfolgen
(Vorschriften für die Probengewinnung, -handhabung und -lagerung sind im NCCLS/CLSI Dokument
veröffentlicht).
Proben: Humanes Plasma mit Tri-Natrium Citrat als Antikoagulanz.
Blutabnahme: Blut (9 Volumenteile) wird vorsichtig in 0,109 M Citrat als Antikoagulanz (1 Volumenteil)
abgenommen. Die Blutabnahme erfolgt durch Venenpunktion, wobei jegliche Gerinnungsaktivierung
vermieden werden muss.
Zentrifugation: Die Herstellung von plättchenarmem Plasma hat innerhalb von 2 Stunden nach
Blutabnahme gemäß einem validierten, laborspezifischen Verfahren zu erfolgen, z.B. durch
Zentrifugation bei Raumtemperatur (18-25°C) für 15 Minuten bei 2500g. Das Plasma wird
anschließend in ein Kunststoffröhrchen überführt.
Lagerung der Plasmaproben bis zu:
 4 Stunden bei Raumtemperatur (18-25°C).
 1 Monat tiefgefroren bei -20°C oder
 18 Monate bei -70°C
Gefrorene Plasmaproben sollten bei 37°C zügig aufgetaut, gut durchmischt und dann sofort getestet
werden. Jegliche Ablagerungen sind durch gründliches Mischen sofort nach dem Auftauen und vor
dem Testen zu resuspendieren.
TESTDURCHFÜHRUNG:
Der Testkit BIOPHEN® DiXa-I wurde spezifisch als kinetische Methode zur Durchführung auf
Gerinnungsautomaten entwickelt, kann aber auch als Endpunkt-Methode durchgeführt werden.
Geräteadaptionen sind auf Anfrage erhältlich. Der Test wird bei einer Temperatur von 37°C
durchgeführt, die Farbentwicklung bei 405 nm gemessen.
Automatisierte Methoden:
Anleitungen für Gerinnungsautomaten sind auf Anfrage erhältlich. Die Substanz (DTI) sowie die
gerätespezifische Adaptionsanleitung und Warnhinweise sind zu beachten.
D750-02/BI/1030
Bestimmung von Rivaroxaban:
1) Kalibratoren gemäß deren Packungsbeilage vorbereiten. Kalibrationsplasma sollte verdünnt werden
wie in der unten stehenden Tabelle beschrieben. Die Kalibrationskurve ist zu erstellen und mittels
Qualitätskontrollen innerhalb einer Stunde zu überprüfen.
2) Proben, Kontrollen und Kalibratoren wie nachfolgend angeführt verdünnen:
Test
Kalibrator (Art.Nr.)
Kontrolle (Art.Nr.)
Rivaroxaban
Rivaroxaban (Niedrig)
222701
226001
224501
225101
Verdünnung in
Reagenz 3
1/15
1/3
Es sind die genauen Konzentrationen der Kalibratoren und Kontrollen zu beachten, die für das
jeweilige Lot auf dem im Kit enthaltenen Zertifikat vermerkt sind.
3) In ein bei 37°C präinkubiertes Kunststoffröhrchen nach folgendem Schema hinzufügen:
Reagenz
Menge
Kalibratoren, Testplasma oder Kontrollen (mit R3
200 µl
verdünnt)
R1 Humaner FXa präinkubiert bei 37°C
200 µl
Mischen und 1 Minute bei 37°C inkubieren, dann zugeben:
R2 Substrat präinkubiert bei 37°C
200 µl
Mischen und exakt 45 Sekunden bei 37°C inkubieren.
Stoppen der Reaktion durch Zugabe von:
Zitronensäure (2 %) oder 20 % Essigsäure
400 µl
Mischen und Messung der Absorption bei 405 nm gegen den entsprechenden Probenleerwert.
Die gebildete Gelbfärbung ist für 2 Stunden stabil. Der Probenleerwert bei der Endpunktbestimmung
wird durch Mischen der Reagenzien in der umgekehrten Testreihenfolge erhalten, d.h. Essigsäure (20
%), Zitronensäure (2 %), Substrat, FXa, verdünnte Probe. Die Absorption des Probenleerwertes bei
405 nm ist von der Absorption des entsprechenden Probenwertes abzuziehen.
Bestimmung von Apixaban:
1) Kalibratoren gemäß deren Packungsbeilage vorbereiten. Kalibrationsplasma sollte verdünnt werden
wie in der unten stehenden Tabelle beschrieben. Die Kalibrationskurve ist zu erstellen und mittels
Qualitätskontrollen innerhalb einer Stunde zu überprüfen.
2) Proben, Kontrollen und Kalibratoren wie nachfolgend angeführt mit Reagenz 3 (Puffer) verdünnen:
Test
Apixaban
Apixaban (Niedrig)
Kalibrator
(Art.Nr.)
226201
226101
Kontrolle
(Art.Nr.)
225301
225201
Verdünnung in Reagenz 3
1/40
1/6
Es sind die genauen Konzentrationen der Kalibratoren und Kontrollen zu beachten, die für das
jeweilige Lot auf dem im Kit enthaltenen Zertifikat vermerkt sind.
3) In ein bei 37°C präinkubiertes Kunststoffröhrchen nach folgendem Schema hinzufügen:
Reagenz
Menge
Kalibratoren, Testplasma oder Kontrollen (mit R3
200 µl
verdünnt)
R1 Humaner FXa präinkubiert bei 37°C
200 µl
Mischen und 1 Minute bei 37°C inkubieren, dann zugeben:
R2 Substrat präinkubiert bei 37°C
200 µl
Mischen und exakt 45 Sekunden bei 37°C inkubieren.
Stoppen der Reaktion durch Zugabe von:
Zitronensäure (2 %) oder 20 % Essigsäure
400 µl
Mischen und Messung der Absorption bei 405 nm gegen den entsprechenden Probenleerwert.
Die gebildete Gelbfärbung ist für 1 Stunde stabil.
Der Probenleerwert bei der Endpunktbestimmung wird durch Mischen der Reagenzien in der
umgekehrten Testreihenfolge erhalten, d.h. Essigsäure (20 %), Zitronensäure (2 %), Substrat, FXa,
verdünnte Probe. Die Absorption des Probenleerwertes bei 405 nm ist von der Absorption des
entsprechenden Probenwertes abzuziehen. Falls die verwendete Methode andere Reagenzvolumina
als die oben beschriebenen erfordert, müssen die Verhältnisse der Reagenzkonzentrationen genau
eingehalten werden, um den Erhalt der Leistungsmerkmale des Tests zu gewährleisten.
KALIBRATION:
Der Test kann für die Messung von Apixaban und Rivaroxaban kalibriert werden. Entsprechende
Kalibrationsplasmen sind erhältlich (s. Auflistung auf Vorseite). Bei den gezeigten Kalibrationskurven
handelt es sich lediglich um ein Beispiel, das mit der manuellen Methode (Wasserbad) erstellt wurde.
Zur Bestimmung der DiXa-I-Konzentration darf ausschließlich eine selbst erstellte Kalibrationskurve
verwendet werden.
QUALITÄTSKONTROLLE:
Die Verwendung von Qualitätskontrollplasmen ermöglicht, bei Verwendung der gleichen
Reagenzchargen, die Validierung der Kalibrationskurve und der homogenen Reaktivität von Analyse
zu Analyse. Bei jeder Testserie ist eine Qualitätskontrolle (mit unterschiedlichen Werten) zu
inkludieren. Eine neue Kalibrationskurve muss bei Wechsel der Testkitcharge, größeren
Wartungsarbeiten am Messgerät und wenn die gemessenen Werte außerhalb des zu erwartenden
Bereiches liegen, erstellt werden. Jedes Labor kann, entsprechend der verwendeten Testvorschriften
und Geräte, eigene Vertrauensbereiche festlegen.
ERGEBNISSE:
 Bei der Endpunktmethode:
o
Rivaroxaban (Niedriger Bereich): Lin-Log-Skala nutzen (ng/ml)
o
Rivaroxaban (Normaler Bereich): Lin-Lin-Skala nutzen (ng/ml)
o
Apixaban: Für beide Messbereiche Lin-Lin-Skala nutzen
 Bei der Endpunktmethode wird die DiXa-I Konzentration (ng/ml) auf der x-Achse (Abszisse / Lin)
gegen die korrespondierende Absorption (A405) auf der y-Achse (Ordinate) aufgetragen.
 Das Verhältnis zwischen DiXa-I-Konzentration und Absorption ist umgekehrt proportional. Die
Kalibrationskurve wird gezeichnet und r² kalkuliert. Ist r²  0.98 und die Messwerte der Kontrollen
liegen innerhalb der Akzeptanzgrenzen, ist die Kalibration gültig.
 Die DiXa-I-Konzentration in der Probe wird von der Kalibrationskurve abgelesen. Die Ergebnisse
werden in ng/ml DiXa-I angegeben.
 Die Ergebnisberechnung bei der kinetischen Methode erfolgt entsprechend, durch Auftragung der
A405-Werte anstelle der A405-Werte.
 Bei der automatisierten Durchführung werden die Ergebnisse der Proben entsprechend der
gemessenen Kalibrationskurve und der Probenverdünnung automatisch berechnet.
 Der dynamische Bereich im normalen Messereich beträgt für Rivaroxaban etwa 0 - 500 ng/ml und
für Apixaban 0 - 600 ng/ml.
 Der dynamische Bereich im niedrigen Messereich beträgt für Rivaroxaban etwa 0 - 100 ng/ml und
für Apixaban 0 - 120 ng/ml.
EINSCHRÄNKUNGEN:
Aktivierung der Gerinnung bei der Probengewinnung und Aufarbeitung muss vermieden werden.
Plasmen mit ungewöhnlichem Aussehen sind zu verwerfen.
Um die optimale Testleistung zu erzielen, muss die Arbeitsanleitung genau befolgt werden.
ERWARTETE WERTE:
Apixaban und Rivaroxaban sind im normalen Plasma abwesend. Normaler Bereich, therapeutischer
Bereich und Blutungsbereich sind anhand der aktuellen lokalen Vorgaben zu definieren. Die
Ergebnisse sind orientiert am klinischen und biologischen Zustand des Patienten zu interpretieren.
SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE:
Die Werte werden validiert, wenn der VK-Wert kleiner oder gleich 5% (Intra-Assay) bzw. kleiner oder
gleich 10% ist (Inter-Assay). Beispiel für STA-R:
Bestimmung von Rivaroxaban
Bestimmung von Apixaban
Messbereich
0-500 ng/ml
0-100 ng/ml
0-600 ng/ml
0-120 ng/ml
(ng/ml)
N
VK %
N
VK %
N
CV %
N
VK %
Intra-Assay
30
2,17
30
2,50
30
1,47
30
1,78
Inter-Assay
10
3,35
10
6,97
10
4,10
12
5,85
 Dieser Test wurde entwickelt, um Interferenzen mit Plasmafaktoren zu minimieren.
 Der Test ist spezifisch und sensitiv und bietet eine hohe Flexibilität im dynamischen Bereich durch
Anpassung der bei der Testdurchführung verwendeten Verdünnung.
 Der Test ist für die Bestimmung von Rivaroxaban/Apixaban kalibriert und optimiert. Die Kurven sind
für die DiXa-I-Konzentration, ausgedrückt in ng/ml, erstellt. Wird ein anderer DiXa-I benutzt, muss
der Anwender die spezifische Anti-Xa-Aktivität der verwendeten Substanz beachten.
REFERENZEN:
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College of Chest Physicians Evidence-based clinical practice guidelines (8th edition) Chest Suppl. 133(8
suppl):234S-256S ; 2008. Erratum in Chest 2008 Aug; 134(2)473.
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Haemost 2: 346-348; 2004 .
4. Hirsh J, Dalen JE, Deykin D, Poller L. Heparin : mechanism of action, pharmacokinetics, dosing considerations,
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5. Perzborn E, Strassburger J, Wilmen A, Pohlmann J, Roehrig S, Schlemmer K-H, Straub A. In vitro and in vivo
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Population pharmacokinetics and pharmacodynamics of once- and twice-daily rivaroxaban for the prevention of
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Blood coagulation and Fibrinolysis. 2001. Vol 12, No 4. 229-236.
SYMBOLE:
Verwendete Symbole und Zeichen sind gelistet in der ISO-Norm 15223-1.
HYPHEN BioMed
D750-02/BI/1030

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