Structural Characterization of Oligoprolines and - ETH E

DISS. ETH Nr. 23114
Structural Characterization of Oligoprolines
and their Application as
Molecular Scaffolds in Tumor Targeting
A dissertation submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Patrick Wilhelm
Master of Science, University of Basel
born on 18.03.1984
citizen of Safenwil (AG), Switzerland
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Helma Wennemers, examiner
Prof. Dr. Jonathan Hall, co-examiner
2015
Abstract
This thesis explores the structural parameters of oligoprolines and their application
as molecular scaffolds in tumor targeting.
The first part of this thesis deals with the structural elucidation of oligoprolines. The
crystal structure of a hexaproline not only revealed the helical pitch of the PPII-helix
to be 8.98 Å, but also provided valuable insights into the occurrence of non-covalent
interactions between adjacent amide bonds. Additionally, a correlation between the
backbone dihedral angles and the conformation of the corresponding pyrrolidine ring
was observed. The structural integrity of PPII-helical oligoprolines was investigated
by EPR spectroscopy. The persistence length was determined to be 3.0 - 3.5 nm in
water. NMR spectroscopy was used to allow for the analysis of distinct proline
residues within an oligoproline in solution. To overcome the signal overlap, typical for
homo-oligomeric structures, a paramagnetic metal was tagged to the hexaproline.
The induced signal dispersion of the chemical shifts allowed for a complete peak
assignment – an important step towards the elucidation of a fine-structure of
PPII-helical oligoprolines in solution.
In the second part of this thesis, oligoprolines were used as molecular scaffolds for
tumor targeting. Oligoprolines were functionalized with peptidic ligands derived from
the endogenous ligand of the human Somatostatin receptor. The difference in
receptor expression between healthy (normal expression) and cancer cells
(overexpression) can be used to specifically address cancer cells. In vitro evaluations
of monovalent, homodivalent, and hybrid conjugates exhibited a specific uptake into
the cancer cells. Though this evaluation showed that the oligoproline scaffold hinders
the tumor uptake of the conjugate, a suitable distance between two agonistic ligands
overcompensated the hindrance of the oligoproline scaffold leading to an enhanced
tumor uptake.
In summary, the first part of this thesis describes our contributions to the structural
elucidation of PPII-helical oligoprolines. The gained insights were used in the second
part of this thesis to synthesize distance-controlled oligoproline-conjugates for tumor
targeting.
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Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit behandelt die strukturellen Eigenschaften von Oligoprolinen
und ihrer Anwendung als funktionalisierbares Gerüst im Bereich der gezielten
Adressierung von Tumorzellen.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Strukturanalyse von Oligoprolin. Die
Basis hierfür lieferte die erfolgreiche Kristallisation eines Prolin Hexamers. Die
Kristallstrukturanalyse ermöglichte nicht nur eine genaue Bestimmung der Ganghöhe
der PPII-Helix von 8.98 Å, sondern lieferte ebenfalls wichtige Hinweise auf nichtkovalente Wechselwirkungen zwischen benachbarten Amiden. Zusätzlich konnte ein
Zusammenhang zwischen den Diederwinkeln und der Konformation des jeweiligen
Pyrrolidinrings
gezeigt
werden.
spinresonanz-Spektroskopie
Mittels
wurde
die
Untersuchungen
strukturelle
durch
Integrität
ElektronenPPII-helikaler
Oligoproline untersucht und eine Persistenzlänge von 3.0 - 3.5 nm ermittelt. Mit dem
Ziel eine Analyse von Oligoprolinen in Lösungen zu ermöglichen wurden NMR
spektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Um der für Homooligomere
typischen Signalüberlappung der einzelnen Wiederholungseinheiten zu entgegnen,
wurde ein Chelator an das Oligoprolin gebunden und mit einem paramagnetischen
Metall beladen. Die durch Pseudokontaktverschiebungen erzeugte Aufweitung der
Signalverschiebung ermöglichte eine Zuteilung aller Signale im aufgenommenen
Spektrum – eine wichtige Voraussetzung für spätere Experimente auf dem Weg zur
Strukturaufklärung von Oligoprolinen in Lösung mittels NMR-Spektroskopie.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Oligoproline distanzkontrolliert mit peptidischen
Liganden funktionalisiert um Tumorzellen gezielt zu adressieren. Die peptidischen
Liganden wurden von den endogenen Bindungspartnern des Rezeptors abgeleitet,
welcher auf gewissen Tumorzellen überexprimiert vorkommt. Dieser Unterschied
kann genutzt werden um Tumorzellen von gesunden Zellen zu unterschieden.
Untersuchungen an homodivalenten Konjugaten mit je zwei agonistischen und
antagonistischen Liganden, sowie Hybrid-Konjugaten, funktionalisiert mit beiden
Liganden, zeigten eine spezifische Aufnahme der Konjugate in die Tumorzellen.
Allerdings hindert das Oligoprolin die Aufnahme der Konjugate in die Tumorzelle.
Trotzdem konnte bei geeigneter Distanz zwischen beiden Liganden auf dem
Oligoprolin-Gerüst eine erhöhte Aufnahme der Konjugate in die Tumorzellen erreicht
werden.
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Zusammenfassend wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit massgeblich zur
Aufklärung der Struktur sowie der dynamischen Eigenschaften von Oligoprolinen
beigetragen. Des Weiteren konnten diese Erkenntnisse im zweiten Teil der Arbeit
genutzt werden um distanzkontrollierte Konjugate zur gezielten Adressierung von
Tumorzellen herzustellen.
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