Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Institut für Pathologie: Molekularpathologie Direktor: Professor Dr. med. Guido Sauter Unter der Leitung von Martina Kluth Identifizierung tumorrelevanter Gene innerhalb der 6q14-16 Deletion beim Prostatakarzinom Dissertation Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Humanmedizin Medizinische Fakultät der Universität Hamburg vorgelegt von Omar Habib 2014 http://d-nb.info/1068878452 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 3 1 Einleitung 5 2 Material und Methoden 8 2.1 Zelllinien 8 2.2 Medien 8 2.3 Zellpflege 9 2.4 kommerzielle shRNA-Konstrukte 10 2.5 TaqMan-Sonden 15 2.6 Verwendete Western Blot Antikörper 16 2.7 Reagenzien und kommerzielle Kits 16 2.8 Material und Geräte 17 2.9 Verwendete Lösungen 19 2.10 Plasmid-Isolierung von shRNA-Konstrukten 20 2.11 RNA Isolation aus Prostatazelllienien 20 2.12 Konzentrations- und Reinheitsbestimmungen von RNA- und DNA Proben 21 2.13 Reverse Transkription 22 2.14 TaqMan-PCR 22 2.15 Proteinisolation 23 2.16 Proteinbestimmung 23 2.17 Bestimmung der Zellzahl 24 2.18 Western Blot 24 2.19 Transfektion von shRNA-DNA-Plasmiden mit Lipofectamin2000 25 2.20 Produktion von viralen Vektoren 25 2.21 Transduktion mit viralen Vektoren 26 2.22 Colony-Formation-Assay 26 2.23 Datenbanken und Analyseprogramme 27 3 Ergebnisse 28 3.1 Expression der 30 ausgewählten Kandidatengene in Prostata-Zelllinien 28 3.2 Auswahl der optimalen shRNA-Konstrukte für die Depletionsexperimente 31 3.3 Einfluss der Vektor-Transduktion auf die Genexpression 34 3.4 Quantifizierung des depletions-bedingten Wachstumseinflusses mittels Colony-Formation Assay 38 Inhaltsverzeichnis 4 3.5 Validierung der potentiellen Zielgene der 6q14-16 Deletion 3.5.1 Colony-Formation Assay 3.5.2 Depletionseffiziens auf mRNA Ebene mittels TaqMan-PCR 3.5.3 Depletionseffiziens auf Proteinebene mittels Westernblot 43 43 48 52 4 Diskussion 53 5 Zusammenfassung 60 6 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 61 7 Abkürzungsverzeichnis 62 8 Literaturverzeichnis 63 9 Lebenslauf 66 10 Eidesstattliche Versicherung 67 4