Immunologische Methoden und Enzymassays 1. Antikörper (Ak) Aufbau, Struktur monoklonale und polyklonale Ak 2. Immunpräzipitation 3. Affinitätschromatographie 4. Immundetektion 5. Immunblot 6. Immunhistochemie 7. ELISA Aufbau Sandwich -55- Antikörper - Struktur Immunsystem Angeborene oder unspezifische Abwehr (Innate Immunity) • sehr früh in der Stammesgeschichte der Lebewesen entwickelt < anatomische und physiologische Barrieren < Makrophagen, Natürliche Killerzellen, Neutrophile Zellen < Antimikrobielle Peptide < verhindert ca. 90% aller Infektionen Erworbene, adaptive oder spezifische Abwehr (adaptive Immunity) • entwickelte sich bei Wirbeltieren • passt sich neuen Krankheitserregern an • erkennt spezifische, körperfremde Strukturen (Antigene) • entwickelt zelluläre Abwehrmechanismen und molekulare Antikörper T-Lymphozyten (T-Zellen) • entstehen im Knochenmark aus den Lymphoblasten und reifen im Thymus aus • tragen an ihrer Oberfläche einen T-Zell-Rezeptor (TCR), mit dem jede T-Zelle jeweils ein spezifisches Antigen erkennen kann (Schlüssel-Schloss-Prinzip). • T-Zellen erkennen nur Antigene, die im Komplex mit MHCMolekülen auf der Oberfläche körpereigener Zellen präsentiert werden. B-Lymphozyten (B-Zellen) • entwickeln sich wie alle Abwehrzellen im Knochenmark • “erkennen” über Rezeptoren ihr Antigen und können dann durch Lymphokine aktiviert werden • aktivierte B-Zellen entwickeln sich zu Antikörperproduzierenden Plasmazellen oder Gedächtniszellen • B-Zellen erkennen auch freie Antigene -56- Antikörper IgA (Dimer) wird auf Schleimhäuten der Atemwege, der Augen, des Magen-Darm-Trakts, des Urogenitaltrakts sowie über spezielle Drüsen rund um die Brustwarze von Müttern sezerniert IgE (Monomer) Schützt vor Parasiten (z. B. Würmer) Membrangebunden auf Mastzellen, in Blut kaum vorhanden Quervernetzung bei Antigenkontakt K Ausschüttung von Histaminen, Granzymen usw. durch Mastzellen und Granulozyten (allergische Reaktion) IgM (Pentamer) wird bei Erst-Kontakt mit Antigenen gebildet zeigt akute Infektionsphase einer Krankheit an (Zeichen einer frischen Infektion) 10 Bindestellen für Antigene (starke Agglutination) IgG (Monomer) wird in verzögerter Abwehrphase gebildet (3 Wochen) bleibt lange erhalten zeigt durchgemachte Infektion oder Impfung an plazentagängig IgD (Monomer) in geringen Mengen in Blut und Lymphe vorhanden Funktion unbekannt -57- Gewinnung von Antikörpern Polyklonale Seren (polyklonale Antikörper) • Protein, Peptid oder andere Verbindung einem Tier spritzen (Immunsystem) • Immunsystem erkennt Fremdstoff und produziert Antikörper (zuerst IgM dann IgG) • Mischung verschiedener, gegen diverse Epitope/Antigene gerichteter Antikörper • Serum direkt in Assays einsetzen oder Ak anreichern Quelle Serum Typ Menge Polyklonal IgG IgA IgM IgD IgE IgY • • • • 8 - 16 mg/mL 1 - 4 mg/mL 0,5 - 2 mg/mL bis 0,4 mg/mL bis 4 :g/mL Hybridoma Monoklonal bis 4 mg/mL Eigelb IgY 3 - 4 mg/mL In vitro Rekombinant auch: Hühner IgG, Eigelb IgG oder 7S-IgG Äquivalent zu IgG bei Hühnern; ähnliche Struktur in hoher Konzentration in Eiern bietet für bioanalytische Zwecke verschiedene Vorteile gegenüber IgG -58- Monoklonale Antikörper (mAk) Immunisierung von Mäusen (Ratten) Milz entnehmen Milzzellen mit Krebszellen verschmelzen K Hybridomzelllinie • können sich beliebig oft teilen (“unsterblich”) • produziert Antikörper (z.B. IgG) Einzelne Klone der Hybridomzelllinie isolieren und vermehren K monoklonal! -59- Immunpräzipitation Antikörper erkennen Antigene in Lösung Antikörper-Antigen-Komplex präzipitiert insbesondere wenn mehrere Epitope an einem Protein erkannt werden Variante Antikörper an Trägermaterial (Beads) immobilisieren und damit Antigen herausfangen Magnetische Beads: Mit Magnet abtrennen K automatisierbar -60- Affinitätschromatographie • Säule mit aktiviertem Trägermaterial • Antikörper chemisch an Trägermaterial koppeln • Antikörper immobilisiert • Proteinmischung auftragen • Antigen bindet spezifisch • Antigen eluieren (schwach sauer) • Antikörper wird nicht denaturiert, so dass Säule wieder verwendet werden kann (bis 100x) Falls ein spezifischer mAk zur Verfügung steht, kann jedes Protein angereichert werden z.B. modifizierte Proteine -61- Immundetektion Proteine spezifisch mit Antikörper nachweisen meist Signalverstärkung über Amplifikation (A) z.B. Enzyme (Peroxidase, Phosphatase), PCR a: direkt: Ak markiert b: indirekt: sek. Ak markiert c,d: indirekt, polyklonaler Peroxidase-Komplex e: Biotin-Avidin-System f: Protein A g: direkte Protein A Gold-Methode h: indirekte Protein A Gold-Methode j: Lektin k: Antigen l: Nachweis des Ak über Antigen m: Sandwich-Methode -62- Immunoblot Proteine nach gelelektrophoretischer Trennung auf eine Membran transferieren (Westernblot) Aktive Oberfläche der Membran blockieren (Milchpulver, BSA) Mit Antikörper inkubieren und 1. Direkter Nachweis Fluoreszenzfarbstoff Enzym (z.B. Peroxidase K Farbreaktion) 2. Nachweis mit sek. Ak z.B. Ziege anti-Maus IgG sek. Ak mit Enzym markiert (Farbreaktion) B A 103 kDa 77 kDa 50 kDa 103 kDa 77 kDa 50 kDa 34 kDa 28 kDa 20 kDa 34 kDa 28 kDa 20 kDa St St 1 2 SDS-PAGE 3 10 zweidim. Gelelektrohporese Spezifischer Nachweis eines Proteins in Gegenwart großer Mengen anderer Proteine K Reinigung kontrollieren Proteine/Modifikationen nachweisen (Identifizierung) -63- Immun-Histochemie Gewebeschnitt anfertigen Antikörper-Lösung auftragen Antikörper bindet im Gewebe an Antigen Detektion: z.B. Fluoreszenzfarbstoffe Drei Modifikationen des Tau-Proteins parallel nachweisen: HPT-1 HPT-101 AT8 merge -64- ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest Direkter ELISA Probe mit Antigen an fester Oberfläche adsorbieren (Well) Aktive Oberfläche blockieren (BSA, Milchpulver) Antikörper zugeben (direkte Detektion, z.B. über Fluoreszenz) Sek. Ak zugeben (mit gekoppeltem Enzym) Detektion über Enzymumsatz (z.B. Farbstoff bilden) 1,6 1,4 1,2 OD 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 1:100 1:300 1:600 1:1200 1:2400 1:4800 1:9600 1:19200 Antigen dilution Sandwich ELISA Antikörper an Platte binden Probe mit Antigen zugeben Ak fängt Antigen (Fänger-Ak) mit zweitem Ak Antigen detektieren (direkte Detektion) mit sek. Ak nachweisen (Enzym - Farbstoff) sek. Ak Protein POD Detektor-Ak Fänger-mAk -65- -66-
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