LC trifft MALDI-MS

Industrie-Applikationen
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LC trifft MALDI-MS
Regina Römling
Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg
HPLC getrennt und identifiziert
werden. Die Identifizierung erfolgt in allen Fällen über die
Massenspektren der Peptide. All
diese unterschiedlichen Trennverfahren stellen daher eigentlich nur die Probenvorbereitung
für die massenspektrometrische
Analyse dar. Die Zahl der Proteine, die aus einer hochkomplexen Mischung identifiziert
werden können, hängt neben
der erreichten Auflösung dieser
Probenvorbereitung auch wesentlich von der Qualität der
Massenspektren ab.
Abb. 1: AccuSpot Mikrofraktionierer.
Ein Kernproblem in der Proteomforschung ist die Identifizierung einzelner Proteine in
komplexen Matrizes. Üblicherweise wird hierzu die Auftrennung eines Zellextraktes mittels
zweidimensionaler Gel-Elektrophorese (2D-PAGE) verwendet.
Das Trennverfahren beruht in
der ersten Dimension auf einer
Trennung nach Ladung der Proteine und in der zweiten Dimension nach deren Größe bzw.
Molekulargewicht. Um einzelne
Proteine anschließend identifizieren zu können, werden diese
im Gel enzymatisch gespalten
und die Massen der Fragmente
mittels massenspektrometrischer Verfahren bestimmt. Dieser Prozess umfasst eine Serie
zeitraubender Arbeitsprotokolle, die nur begrenzt automatisierbar sind. Ferner ist der Bereich der detektierbaren Proteine eingeschränkt. Hydrophobe
Proteine (wie etwa Membranproteine, sehr kleine Proteine
und Proteine in extrem geringer
Konzentration) können mit
elektrophoretischen Methoden
allein nicht identifiziert werden.
Als Alternative werden in letzter
Zeit verstärkt chromatographische Methoden diskutiert.
Schon seit längerem werden
unterschiedlichste Methoden
der mehrdimensionalen Flüs-
Charakterisierung mittels
MALDI-MS
sigchromatographie (MDLC) für
die Auftrennung der komplexen Peptidmischungen verwendet[1, 2].
Junichi et al. zeigten zum Beispiel auf der diesjährigen Tagung der Amerikanischen Gesellschaft für Massenspektrometrie (ASMS) Unterschiede zwischen der Trennung mittels klassischer 2-D Gel-Elektrophorese und MDLC-Trennungen.
Nach einer groben Vorfraktionierung wurden die Proteine aus
Cerebrospinalflüssigkeit proteolytisch gespalten und mit dem
neuen Shimadzu 2D-KapillarHPLC Systems und MSn-Detektion analysiert. Aus 509 detektierten Peptiden konnten
mittels Mascot-Datenbank-Recherche insgesamt 126 Proteine
identifiziert werden. Nur 60%
dieser Proteine waren aus der
Analyse auf Basis klassischer
2D-Elektrophorese bereits bekannt[3, 4].
Ein anderer Ansatz verbindet
elektrophoretische und chromatographische Trenntechniken.
So können zum Beispiel nach
der gel-elektrophoretischen Auftrennung nach Molekulargewicht die Proteine einzelner
Banden direkt tryptisch gespalten, die entstehenden Peptide
aus dem Gel extrahiert und dann
mittels reversed phase Kapillar-
Zur Identifizierung der Peptide
können verschiedene massenspektrometrische Verfahren eingesetzt werden. Die OnlineKopplung der chromatographischen Trennung mit Elektrospray MSn-Geräten stellt sicher
den höchstmöglichen Grad der
Automatisierung dar. Doch bietet eine offline Kopplung der LC
mit MALDI-MSn-Techniken
große Vorteile bei unvollständiger chromatographischer Trennung der Peptide.
MDLC oder 1D-PAGE gekoppelt mit rp-HPLC kann nie
eine vollständige Auflösung aller Peptide eines Proteoms liefern. Das bedeutet, dass in den
meisten Peaks mehrere Peptide
gleichzeitig eluieren. Bei der online-LC/MS/MS-Kopplung ist
die Zeitspanne, die für die MSMessung der co-eluierenden
Peptide zur Verfügung steht,
entsprechend der Peakbreite der
einzelnen Peaks begrenzt. Die
Scan-Geschwindigkeit des Massenspektrometers setzt hier der
Anzahl der MS/MS-Experimente Grenzen. Daher können selten alle co-eluierenden Peptide
identifiziert werden. Wenn man
nur das Vorhandensein bekannter Peptide in der Probe bestätigen möchte, stellt das kein Problem dar. Ist das Ziel aber die
Charakterisierung möglichst vie-
ler unterschiedlicher Proteine eines Zellextraktes, so ist es vorteilhaft, die MS Messung und
die chromatographische Trennung zeitlich zu entkoppeln.
Für MALDI-MS Messungen
muss die Probe immer offline
auf einem Probenhalter präpariert werden. Die Probe wird zusammen mit einer Matrix aus
kleinen organischen Molekülen
auf einem Probenhalter kristallisiert und dann im MALDIMSn analysiert. Da die Probe in
festem Zustand auf dem Probenhalter verbleibt, kann das
MS-Experiment beliebig lange
durchgeführt und optimiert
werden. Üblicherweise werden
zum Beispiel mit dem AximaQITTM, einem MALDI-QITTOF-Massenspektrometer, zunächst durch eine einfache MSMessung Kandidaten für die folgenden MS/MS-Experimente
identifiziert. Das ausgewählte
Peptid - das Precurser-Ion - wird
in der Ionenfalle (QIT) isoliert
und mit Argon als Kollisionsgas
fragmentiert. Die Fragmente
werden dann mit einem Reflektron Time of Flight (TOF) Analysator analysiert. Im Idealfall
kann durch eine Datenbankrecherche in der Mascot-Datenbank (Matrix Science) das Protein, aus dem die untersuchten
Peptide entstanden sind, identifiziert werden. Ein weiterer
a
b
c
Abb. 2a, 2b, 2c: Spot-Technik des
AccuSpot.
BIOspektrum · Sonderausgabe · 10. Jahrgang
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Literatur
[1] Wagner, Y., Sickmann, A., Meyer,
H.E., Daum, G. (2003): Multidimensional nano-HPLC for analysis of protein complexes. J Am Soc Mass Spectrom.
14(9):1003–1011.
Abb. 3: MS/MS des Peptids mit m/z 2023, identifiziert als Phosphoglycerat Kinase I.
Vorteil der MALDI-MS Analyse
ist die Möglichkeit der Archivierung der Probe auf dem
MALDI-Target für spätere Messungen.
Mikrofraktionierung mit dem
AccuSpot
Für die Kopplung von chromatographischen Methoden mit
MALDI-MS-Techniken hat Shimadzu einen neuen Mikrospotter entwickelt. Mit Hilfe des
AccuSpot Mikrospotters können
kontinuierlich und vollautomatisch Nanoliterfraktionen von
Nano- oder Mikro-HPLC-Eluaten auf MALDI-MS-Targets
präpariert werden. Der Spotter
dosiert vollautomatisch die gewünschte Menge Matrixlösung
zum HPLC-Eluat. Die Flussrate der Matrixlösung ist von
100 nl/min bis 50 µl/min variierbar. Herzstück des Spotters ist
die Dreifachnadel mit drei coaxialen Kapillaren. In der innersten Kapillare fließt das HPLCEluat. Die Matrixlösung fließt in
der mittleren Kapillare und
mischt sich an der Spitze der Nadel mit der Probe. Die äußerste
BIOspektrum · Sonderausgabe · 10. Jahrgang
Röhre dient der Reinigung der
Nadel durch Spülflüssigkeit und
Druckluft. Ein XYZ-Roboter
fährt nacheinander bis zu 9
MALDI-Targets im Standard
96-oder 384-Well-MTP-Format
bzw. 18 Targets im Applied-Biosystems-Format unter die Kapillare. Der Tropfen wird so auf der
Platte abgesetzt, dass die Spitze
der Kapillare die Metalloberfläche nicht berührt (Abb. 2). Dies
unterscheidet den AccuSpot von
anderen Mikrofraktionier-Systemen, bei denen die Nadel auf
der Platte aufsetzt und die Probe außen an der Nadel hochgedrückt werden kann. Das führt
dann zu einer ungleichmäßigen
Verteilung der Substanzen über
den Spot und zur Kontamination
der Nadelaußenseite. Eine
CCD-Kamera überwacht die gesamte Mikrofraktionierung.
Abbildung 3 zeigt ein MS/MSSpektrum, das bei der Analyse
eines Zelllysats aus humanen
BJAB-Zellen (Burkitt-Lymphom-Zellinie) gemessen wurde. Das Zelllysat wurde zunächst
mittels Elektophorese getrennt.
Die Bande des Gels, welche Proteine mit einem Molekularge-
wicht zwischen 33 und 42 kDa
enthielt, wurde ausgeschnitten
und die Proteine im Gel enzymatisch gespalten. Die Peptide
wurden aus dem Gel eluiert,
durch rp-Kapillar-HPLC getrennt und mit dem AccuSpot
auf zwei MALDI-Targets im
Mikrotiterplattenformat fraktioniert. Aus dem Massenspektrum
des Peptids mit m/z 2023 und
den Spektren weiterer Peptiden
wurde in der Datanbankrecherche die Phosphoglycerat Kinase
I als ein Protein des Zellysats
identifiziert. Analog wurden 22
weitere Proteine identifiziert[5].
Im Vergleich zu onlineLC/MS/MS-Methoden erlaubt
die Immobilisierung der Probe
auf einem MALDI-Target die
Datenaufnahme über einen längeren Zeitraum. Ein wichtiger
Vorteil, wenn MS/MS von coeluierenden Peptiden oder eine
Wiederholungsmessung gefordert ist. Der AccuSpot Mikrospotter eignet sich ideal als Verbindungsglied für die Kopplung
chromatographischer Trennungen, wie zum Beispiel 2Dnano/kapillar-HPLC mit HighEnd-Massenspektrometern.
[2] Wolters, D.A., Washburn, M.P.,
Yates, J.R., 3rd. (2001): An automated
multidimensional protein identification
technology for shotgun proteomics. Anal
Chem. 73(23):5683–5690.
[3] Sickmann, A., Dormeyer, W.,
Wortelkamp, S., Woitalla, D., Kuhn,
W., Meyer, H.E. (2002): Towards a high
resolution separation of human cerebrospinal fluid. J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life
Sci.771(1–2):167–196.
[4] Masuda, J.1; Saito, K.2; Yang,
X.1; Nishimura, M.3; Ueda, T.4;
Kowalak, J. A.1; Markey, S. P.1; 1National Institute of Mental Health, Bethesda, MD; 2Gifu University, Gifu, Japan;
3Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Columbia, MD; 4Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan (2004): Proteomic Analysis of
Human Cerebrospinal Fluid after PreFractionation Using Automated 2D Nano
HPLC/MS. ASMS, Poster ThPW 480
[5] Martin, R. L.1, Raptakis, E.1;
Bienvenut, W.2; 1Shimadzu Biotech,
Manchester, UK; 2IDE-ALP Pharma, Lyon,
France (2004): Characterization of Complex Protein Gel Bands by Offline LC
MALDI-QIT-TOF-MS. ASMS, Poster TPY
452.
Korrespondenzadresse:
Regina Römling
Shimadzu Deutschland GmbH
Albert Hahn Str. 6-10
D-47269 Duisburg
Tel.: 0203-76870
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