Zusammenfassung 3 Zusammenfassung Während die Mechanismen der Geruchsgewöhnung auf der Ebene des Riechkolbens und höherer Gehirnregionen bereits seit längerer Zeit untersucht werden, ist deutlich weniger über die zugrunde liegenden Mechanismen in der Peripherie, dem olfaktorischen Epithel, bekannt. Um neue Einblicke in die zur Geruchsgewöhnung führenden molekularen Ereignisse zu erhalten, wurde kürzlich unter Anwendung einer Gel-basierten quantitativen proteomischen Strategie untersucht, welchen Einfluss Langzeitbehandlungen mit einem Duftstoff auf die Proteinkomposition des olfaktorischen Epithels haben (Barbour et al. 2008). In einer weiterführenden Studie wurde dann im ersten Teil der vorliegenden Arbeit eine differentielle Phosphoproteomstudie durchgeführt, um dynamische Veränderungen im Phosphorylierungslevel der Proteine im olfaktorischen Epithel nach Duftstoffaktivierung des Rezeptors zu analysieren. In Anlehnung an die Studie von Barbour et al. wurde ein Gel-basierter Ansatz gewählt, in dem zweidimensionale Gelelektrophorese mit phosphospezifischer Fluoreszenzfärbung mit ProQ® (Pro-Q) Diamond kombiniert wurde. Mit diesem Ansatz konnten Duftstoff-induzierte Veränderungen im Pro-Q gefärbten Proteinmuster detektiert werden. Wie jedoch in dieser Arbeit gezeigt wurde, ist die limitierte Nachweisbarkeit von Phosphorylierungstellen in Pro-Q gefärbten Proteinspots ein großer Nachteil für die Anwendbarkeit dieser Methode auf eine globale Phosphoproteomstudie des OEs. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Geruchsrezeptor vermittelte Signalweiterleitung in nicht olfaktorischen Geweben studiert. Dafür wurde die LNCaP Zelllinie als Modelsystem verwendet. Diese Zelllinie ist eine humane Prostatakarzinom-Zelllinie, die den Prostate-specific G-Protein coupled Receptor (PSGR) endogen exprimiert. Dieser Rezeptor ist ein Mitglied der Familie der olfaktorischen Rezeptoren und wird spezifisch in der Prostata und in Prostatakrebszellen exprimiert wird. Um das Phosphoproteom und insbesondere die Duftstoff-induzierten dynamischen Veränderungen im Protein-Phosphorylierungslevel in LNCaP Zellen zu analysieren, war es erforderlich, einen leistungsfähigen phosphoproteomischen Ansatz zu etabieren, der eine umfassende Charakterisierung und akkurate Quantifizierung von tausenden von Phosphopeptiden in einem einzigen Ansatz ermöglicht. Zu diesem Zweck wurde ein Phosphoproteomansatz etabliert und optimiert, der multidimensionale Peptidauftrennung und Titandioxid-basierte Phosphopeptidanreicherung mit Messungen an „state-of-the-art“ LC/MS Systemen (LTQ-Orbitrap XL und HCT Ultra PTM) unter Verwendung von Electron Transfer Dissociation (ETD) und Multistage Activation (MSA) Fragmentierung und adäquater bioinformatischer Datenanalyse vereint. Dieser Ansatz wurde zunächst für die globale Analyse des Phosphoproteoms von Orthovanadatbehandelten LNCaP-Zellen verwendet. Dieses Experiment wurde in zwei unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt, für die jeweils nur 200 µg Ausgangsmaterial verwendet wurde. Mittels der 3 Zusammenfassung Messungen auf dem HCT Ultra Ionenfallenmassenspektrometer unter Anwendung der Neutralverlust induzierten ETD Fragmentierung wurden 891 Phosphopeptide identifiziert. Unter Verwendung eines LTQ-Orbitrap Massenspektrometers mit MSA Fragmentierung konnten insgesamt 1310 Phosphopeptide identifiziert werden. Diese beiden Datensätze waren hochgradig komplementär. Insgesamt wurden 2095 nicht-redundante Phosphopeptide aus 726 verschiedenen Phosphoproteinen identifiziert. In den identifizierten Phosphopeptiden konnten insgesamt 2569 einzelne Phosphorylierungsstellen identifiziert werden, von denen 164 bislang unbekannt waren, und die in dieser Arbeit erstmalig nachgewiesen wurden. Einige der neu entdeckten Phosphorylierungsstellen kommen in Proteinen vor, die im Kontext von Prostatakrebs von großem Interesse sein könnten, wie z.B. Androgenrezeptor-assoziierte Proteine, Tumorproteine und sieben Kinasen. Diese Proteine stellen neue Kandidatenproteine für weiterführende Studien an Prostatakrebs dar, die im Folgenden zu einem besseren Verständnis der molekularen Prozesse führen könnten, die zur Entstehung und Entwicklung von Prostatakrebs führen. Die Ergebnisse dieser Studie stellen die bislang umfassenste Charakterisierung des Phosphoproteoms von LNCaP Zellen dar. Für die Beobachtung von Geruchsstoff-induzierten dynamischen Veränderungen im Phosphorylierungslevel von Proteinen wurde die Dreifachmarkierung mit Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture für LNCaP-Zellen etabliert und eine zeitaufgelöste und quantitative Phosphoproteomstudie an LNCaP-Zellen, die für jeweils 2 und 10 Minuten mit dem PSGR-Liganden βJonon stimuliert wurden, durchgeführt. Diese Studie wurde in drei Replikaten unter Verwendung von jeweils 200 µg Startmaterial durchgeführt und resultierte in der Identifizierung von insgesamt 1154 individuellen Phosphopeptiden. 99 dieser Phosphopeptide aus 73 verschiedenen Proteinen wurden als differentiell durch β-Jonon Behandlung hoch- und runter-reguliert identifiziert. Niedrig abundante Phosphopeptide wurden typischerweise in einem von drei Replikaten indentifiziert, wenn ausschließlich MaxQuant als Auswertesoftware verwendet wurde. Um die Quantifizierung dieser Peptide zu verbessern, wurde ein Microsoft Excel-basiertes VBA Skript entwickelt, das in dieser Arbeit erfolgreich zum ersten Mal angewendet wurde. Durch die Verwendung dieses Skripts konnte die akkurate Quantifizierung von Peptiden verbessert und eine hohe Reproduzierbarkeit für die ermittelten Regulationsfaktoren gezeigt werden. Auf Basis der differentiell phosphorylierten Proteine konnte eine Hypothese über die initialen Signalereignisse an der Plasmamembran aufgestellt werden. Desweiteren wurden regulierte Phosphorylierungsstellen in einer Reihe von Proteinen identifiziert, die mit der Ausbildung von Junctions und Zell-Zell Kontakten sowie der dynamischen Regulierung des Zytoskeletts in Verbindung gebracht werden, was auf einen Einfluss PSGR-vermittelter Signalwegen auf das Migrationsverhalten der Zellen hinweist. In einem ersten Migrationstest konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit β-Jonon die Migration von LNCaP-Zellen auf einen Serumstimulus hin verhindern kann. Darüber 4 Zusammenfassung hinaus wurden Proteine als differentiell phosphoryliert gefunden, die mit Transkription, Translation und Zell-Zykluskontrolle assoziiert werden. Diese Proteine könnten eine wichtige Rolle für die bereits vorher beschriebene antiprolfieratorische Wirkung von β-Jonon-Stimulation des PSGR spielen und stellen interessante neue Kandidatenproteine für weiterführende Studien dar, da diese wachstumshemmende Wirkung gerade im Zusammenhang mit Prostatakrebs und der Entwicklung von neuen Medikamenten von großer Bedeutung sein könnten. 5
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