Drogenanalytik bei niedrigen und hohen pH

Drogenanalytik bei niedrigen und
hohen pH-Werten mit einer
Agilent Poroshell HPH C18-Säule
mittels LC/MS
Application Note
Small Molecule Pharmaceuticals
Autor
Einführung
William Long
In dieser Application Note werden die LC/MS-Ergebnisse verschiedener
Verbindungen im Zusammenhang mit Drogenmissbrauch bei hohen und niedrigen
pH-Werten verglichen. Dabei werden ein generischer Gradient und ElektrosprayIonisation im Positiv-Ionenmodus (ESI+) verwendet. Normalerweise wäre davon
auszugehen, dass die Ionisation der Analytmoleküle vom pH-Wert der mobilen
Phase abhängt und dass die Ionisationseffizienz in der LC/MS mit ElektrosprayIonisation im positiven Ionenmodus in mobilen Phasen mit hohem pH-Wert deutlich
verringert ist, da die Verbindungen neutral vorliegen. Viele Forscher, die
unterschiedliche Probenarten (wie z. B. Proteine, Peptide und Aminosäuren)
untersuchten, beobachteten jedoch entweder, dass die Ionisation unabhängig von
der Erhöhung des pH-Werts der mobilen Phase ist oder die Empfindlichkeit sogar
steigt [1-6]. Hohe pH-Werte der mobilen Phase unterdrücken also die Ionisation
basischer Substanzen im ESI+-Modus nicht. Positive Ionen werden abundant
gebildet und die Response der Analyten ist bei höheren pH-Werten häufig besser als
bei sauren mobilen Phasen bei niedrigen pH-Werten. Dies ist ein bedeutsames
Ergebnis, da es die Anwendbarkeit typischer Elutionsmethoden auf die Analyse
polarer basischer Substanzen ausdehnt, die zuvor schwer zu retenieren waren.
Agilent Technologies, Inc.
Allerdings wurde für viele Bedingungen, die bei einem hohen pH-Wert verwendet
werden könnten, gezeigt, dass sie schädlich für herkömmliche HPLC-Säulen auf
Silicabasis sind. Die Steuerung des pH-Werts kann durch die Verwendung der
neuen, bei hohen pH-Werten stabilen Säulen wie der Agilent Poroshell HPH
C18-Säule zur Anpassung der Selektivität und der Empfindlichkeit ohne
Beeinträchtigung der Lebensdauer der Säule bei erhöhtem pH-Wert verwendet
werden. Durch die Verwendung dieser Säulen können Chromatographieanwender
jetzt beim Einsatz der Technologie für oberflächenporöse Partikel, die aufgrund ihrer
hohen Effizienz und Geschwindigkeit immer größere Verbreitung findet, einen
größeren pH-Bereich bei der Methodenentwicklung untersuchen [7].
Dichtungen aus PEEK FL sollten bei der Verwendung von
Ammoniumbicarbonatpuffer benutzt werden. Die StandardRotordichtungen in den Agilent Geräten der Serie 1290 sind aus
Vespel und können nur in einem begrenzten pH-Bereich (1-10)
eingesetzt werden. Die Rotordichtungen aus PEEK FL bestehen
aus einem speziellen PEEK-Verbundmaterial, das in einem
größeren pH-Bereich (1,0-12,5) verwendet werden kann.
Das UHPLC-System war auf einem A-Line-Rack montiert.
Das System war mit Leitungen mit 0,075 mm Durchmesser
ausgestattet, um die Dispersion zu minimieren. Dies erzeugt
einen höheren Rückdruck als herkömmliche Leitungen mit
0,12 oder 0,17 mm Innendurchmesser, was jedoch
unproblematisch ist, da die Poroshell HPH C18-Säulen mit 4-µmPartikeln nur wenig eigenen Rückdruck zeigen. In Tabelle 1 sind
die MRM-Übergänge und die gemessenen Ionen aufgeführt.
Experimentelles
Es wurde ein Agilent 1290 Infinity LC-System mit einem
Agilent 6460 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer
verwendet, das aus folgenden Komponenten bestand:
•
Agilent 1290 Infinity Binäre Pumpe für bis zu 1200 bar
(G4220A), modifiziert mit PEEK-Dichtung im LösemittelBypass-Ventil (Rotordichtung, PEEK FL, Best.-Nr. 5068-0171)
•
Agilent 1290 Infinity Thermostatierter Säulenofen (TCC)
(G1316C)
•
Agilent 1290 Infinity Hochleistungsprobengeber (G4226A)
mit PEEK-Rotordichtung (Rotordichtung, PEEK FL,
Best.-Nr. 5068-0170)
•
Agilent Poroshell HPH C18, 3 × 100 mm, 4 µm
(Best.-Nr. 695970-502)
Es wurden 5-mM-Lösungen von Ammoniumformiat und
Ameisensäure hergestellt. Damit wurde ein Puffer bei
niedrigem pH-Wert (pH 3) hergestellt. Ammoniumformiat
wurde von Sigma-Aldrich, Corp. gekauft. Zweifach destillierte
Ameisensäure wurde von GFS gekauft. Ammoniumbicarbonat
und Ammoniumhydroxid wurden verwendet, um einen Puffer
bei pH 10,5 herzustellen; die Substanzen wurden von SigmaAldrich bezogen.
Tabelle 1: MRM-Übergänge für Verbindungen, die in dieser Untersuchung verwendet wurden.
Verbindung
VorläuferIon
Fragmentor- Produktspannung Ion 1
Kollisionsenergie 1
ProduktIon 2
Kollisionsenergie 2
Strychnin
335,2
195
184
41
156
53
Alprazolam
309,1
179
281
25
205
49
MDMA
194,1
97
163
9
105
25
Amphetamin
136,1
66
119,1
5
91
17
Trazadon
372,2
159
176
25
148
37
Meperidin
248,2
128
220,1
21
174,1
17
Verapamil
455,3
158
165
37
150
45
Methadon
310,2
112
265,1
9
105
29
Proadifen
354,2
153
167
29
91,1
45
Diazepam
285,1
169
193
45
154
25
THC
315,2
150
193,2
20
123,3
30
2
Ergebnisse und Diskussion
Schlussfolgerungen
In dieser Application Note, die die Elution der genannten
Verbindungen in einer basischen mobilen Phase mit der
Elution in einer sauren mobilen Phase vergleicht, zeigt sich,
dass die Basen in der basischen mobilen Phase länger
reteniert werden. Basische Substanzen liegen vollständig
protoniert vor und werden mehr zurückgehalten als geladene
Verbindungen in der Reversed-Phase-HPLC. Da die
Verbindungen besser zurückgehalten werden, können am
Lösemittel mehr Anpassungen vorgenommen werden.
Dadurch werden, wie in Abbildung 1 gezeigt, bessere
Peakabstände möglich. Die Eigenschaften der mobilen Phase
und des Gradienten sind in Abbildung 1 angegeben. Darüber
hinaus sind die Peaks einiger Analyten im basischen
Lösemittel größer als in der sauren mobilen Phase. Die Peaks
von Trazodon, Verapamil, Methadon und Proadifen sind in der
basischen mobilen Phase sogar erheblich größer. Dies könnte
einen pH-Effekt darstellen, aber es könnte auch daran liegen,
dass die jeweilige Verbindung länger zurückgehalten wird und
mit einer mobilen Phase eluiert, die einen höheren
organischen Anteil hat.
Es wurde bereits gezeigt, dass eine Agilent Poroshell
HPH-C18-Säule für einen längeren Zeitraum (mehr als 2000
Injektionen) mit mobilen Phasen mit hohem pH-Wert, wie
z. B. einem Ammoniumbicarbonatpuffer bei pH 10, verwendet
werden kann. Daher können Chromatographieanwender jetzt
beim Einsatz der Technologie für oberflächenporöse Partikel,
die aufgrund ihrer hohen Effizienz und Geschwindigkeit immer
größere Verbreitung findet, einen größeren pH-Bereich bei der
Methodenentwicklung nutzen. Die Verwendung mobiler
Phasen mit hohem pH-Wert bei oberflächenporösen Partikeln
ist sowohl nützlich als auch praktisch [8].
Counts
×105
5,5
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Counts
×105
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Zeit
0
0,5
3
6
8
8,5
9
A
5 mM Ammoniumformiat
0,1 % Ameisensäure, pH 3,1, MeOH, 30 °C
1 ml/min
Agilent Poroshell HPH C18, 3 × 100 mm, 4 µm
8
5
7
9
%B
10
15
50
95
95
10
10
6
4 3 1
2
10
11
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Strychnin
Alprazolam
MDMA
Amphetamin
Trazodon
Meperidin
Verapamil
Methadon
Proadifen
Diazepam
THC
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8
Erfassungszeit (Min)
5
B
7
8
10 mM Ammoniumbicarbonat
9
pH 10,5, MeOH, 30 °C
Agilent Poroshell HPH C18, 3 × 100 mm, 4 µm
4
6
3
2
10
1
11
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8
Erfassungszeit (Min)
Abbildung 1: Trennung bei niedrigem und hohem pH-Wert mit einer Agilent Poroshell HPH C18-Säule mit 4-µm-Partikeln.
3
Literatur
1.
2.
R. Chirita-Tampu; C. West, L;Fougere; C. Elfakir.
Advantages of HILIC Mobile Phases for LC–ESI–MS–MS
Analysis of Neurotransmitters. LCGC Europe. 2013, 26,
128-140.
H. P. Nguyen; K. A. Schug. The advantages of ESI-MS
detection in conjunction with HILIC mode separations:
Fundamentals and applications. J. Sep. Sci. 2008, 31,
1465–1480.
3.
S. Zhou; K. D. Cook, J. Am. Soc. Protonation in
electrospray mass spectrometry: Wrong-way-round or
right-way-round? Mass Spectrom. 2000, 11, 961-966.
4.
B. E. Boyes. Separations and Analysis of Peptides at
High pH. 4th WCBP, San Francisco Ca. 2000.
5.
F. E. Kuhlmann; A. Apffel; S. M. Fischer; G. Goldberg;
P. Goodley. Signal enhancement for gradient reversephase high-performance liquid chromatographyelectrospray ionization mass spectrometry analysis with
trifluoroacetic and other strong acid modifiers by
postcolumn addition of propionic acid and isopropanol.
J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1995, 6, 1221-1225.
6.
C. R. Mallet; Z. Lu; J. R. Mazzeo, Rapid Commun. A
study of ion suppression effects in electrospray
ionization from mobile phase additives and solid-phase
extracts. Mass Spectrom. 2004, 18, 49-56.
7.
W. J. Long; A. E. Mack; X. Wang; W. E. Barber.
Selectivity and Sensitivity Improvements for Ionizable
Analytes Using High-pH-Stable Superficially Porous
Particles. LCGC 2015, 33 (4).
8.
A. E. Mack; J. R. Evans; W.J. Long. Fast Analysis of
Illicit Drug Residues on Currency using Agilent
Poroshell 120; Application Note, Agilent Technologies,
Inc. Publikationsnummer 5990-6345EN, 2010.
Weitere Informationen
Diese Daten stellen typische Ergebnisse dar. Weitere
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© Agilent Technologies, Inc., 2015
Gedruckt in den USA,
11. Dezember 2015
5991-6523DEE

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