Screening auf hunderte Pestizidrückstände mithilfe eines

Screening auf hunderte
Pestizidrückstände mithilfe eines
GC/Q-TOF mit einer massengenauen
Pestizid-Datenbank in Lebensmitteln
Application Note
Lebensmittel
Autoren
Abstract
Amadeo R. Fernandez-Alba,
Der Agilent 7200 GC/Q-TOF wurde in Verbindung mit der ersten im Handel
Samanta Uclés, und Noelia Belmonte-
erhältlichen massengenauen Pestizid-Bibliothek anhand des All Ions-
Valles Forschungsgruppe über
Arbeitsablaufs der Agilent MassHunter Qualitative Analysis-Software verwendet,
Pestizidrückstände der Abteilung für
um Pestizidrückstände in fünf verschiedenen Lebensmittelmatrices rasch zu
Hydrogeologie und Analytische Chemie
screenen, zu identifizieren und über diese quantitative Daten zu erstellen. Diese
der Universität von Almería, Almería,
Technik erleichtert die Eliminierung von falschpositiven Ergebnissen und liefert die
Spanien
erforderliche Geschwindigkeit und Genauigkeit, um die Produktivität des Pestizid-
Joerg Riener
Agilent Technologies GmbH
Waldbronn, Deutschland
Screenings und die quantitative Analyse deutlich zu verbessern. Ein ScreeningArbeitsablauf unter Heranziehung der neuen GC/Q-TOF-Pestizidbibliothek
und der speziellen All Ions-Softwaretools ermöglicht den Nachweis von
Pestizidkonzentrationen von nur 10 ppb in komplexen Matrices.
Einführung
Dieser auf GC/Q-TOF basierende Screeningansatz stellt eine
Ergänzung der GC/MS/MS-Analyse von Zielverbindungen
dar. Darüber hinaus ist auch eine nachträgliche Datenanalyse
möglich, da Chromatogramme mit vollständigen EI-Spektren
erfasst werden. Der Anwender kann die Identität unerwarteter
Verbindungen schnell mit hochauflösenden massengenauen
Daten untersuchen. Die Daten zu kritischen Ionen lassen sich
problemlos in eine quantitative Methode exportieren, wenn ein
anschließendes quantitatives Screening für spätere Analysen
für erforderlich gehalten wird. Bei Bedarf können hunderte
Pestizide in einer einzigen Analyse quantifiziert werden.
Angesichts des verstärkten internationalen Handels
von Lebensmitteln und Lebensmittelzutaten spielt die
Lebensmittelsicherheit eine immer größere Rolle. Bei einem
Pestizid-Screening nach dem Stand der Technik müssen
über 1000 Pestizide und ihre Metaboliten berücksichtigt
werden. Davon können 600 bis 700 Verbindungen in
Programme zur Routineüberwachung aufgenommen werden.
Die Methoden müssen viele Verbindungen gleichzeitig
testen, andererseits aber Matrixinterferenzen aufgrund der
vielen unterschiedlichen Lebensmittelmatrices umgehen
können. Die zunehmende weltweite Bedeutung des PestizidScreenings zeigt sich an der Umsetzung der Richtlinie
SANCO/12571/2013 der Europäischen Union (EU) [1].
In der neuesten Fassung sind spezielle Kriterien für das
qualitative Screening mit Unterstützung von Datenbanken
oder Bibliotheken genannt. Ein massengenauer Ansatz für
das Pestizid-Screening mithilfe von Quadrupol-Time-of-FlightMassenspektrometrie (Q-TOF) gewährleistet eine zuverlässige
Pestizid-Identifizierung und das gleichzeitige Screening
einer praktisch unbegrenzten Anzahl von Verbindungen. Für
viele der wichtigsten Verbindungen ist Gaschromatographie
(GC) gekoppelt an ein Q-TOF-Massenspektrometer das
ideale Analysetool für das Screening, die Bestätigung und
Quantifizierung von Zielverbindungen und von unerwarteten
Verbindungen im Spurenbereich, auch in komplexen Matrices.
Experimentelles
Reagenzien und Standards
Alle hochreinen Pestizidstandards stammten von
Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Deutschland), Sigma-Aldrich
(Steinheim, Deutschland) und Riedel-de Haën (Selze,
Deutschland) und wurden bei − 30 °C aufbewahrt. Die
einzelnen Pestizid-Stammlösungen (1000–2000 mg/l) wurden
in Acetonitril angesetzt und in braunen Glasflaschen mit
Schraubverschluss lichtgeschützt bei − 20 °C aufbewahrt.
Aus den Standard-Stammlösungen wurden die einzelnen,
für die Optimierung verwendeten Standardlösungen und ein
10-mg/l-Gemisch aller Standards in Acetonitril hergestellt.
Die Standardgemischlösung wurde nach entsprechender
Verdünnung in Ethylacetat für die Kalibrierung verwendet.
Das Ethylacetat stammte von Fluka Analytical Pestanal,
das Acetonitril von Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland)
und MgSO4 von Panreac Quimica S.A. (Barcelona, Spanien).
Das Primary Secondary Amine (PSA)-Sorbens stammte
von Supelco (Bellefonte, Pennsylvania, USA) und NaCl von
J.T. Baker (Deventer, Niederlande).
Diese Application Note stellt einen Arbeitsablauf für das
Screening von Pestizidrückständen in verschiedenen
Lebensmitteln mithilfe von GC/Q-TOF und ElektronenstoßIonisation (EI) in Kombination mit einer GC-Methode mit
Retention Time Locking [2], Backflushing in der Säulenmitte
für höhere Robustheit der Methode [3] und einer neuen
Bibliothek mit massengenauen Pestizid-Spektren vor.
Danach automatisiert die Agilent MassHunter-Software das
Screening auf die mehr als 700 Pestizide in einer Personal
Compound Database and Library (PCDL). Der Agilent All
Ions-Arbeitsablauf wählt charakteristische massengenaue
Ionen für jede Verbindung in der PCDL und extrahiert sie
aus dem Chromatogramm. Zur Überprüfung der Treffer
werden ein Koelutionsplot und ein Koelutionsscore erstellt,
um die Kovarianz der extrahierten massengenauen Ionen
zu kontrollieren und auszudrücken. Im Koelutionsscore
wird die Retentionszeit samt allen Informationen aus dem
chromatographischen Peak (einschließlich Peakbreite
und -symmetrie) zur Bestimmung der Kovarianz der
charakteristischen Ionen verwendet.
Geräte
Diese Studie wurde mit einem Agilent 7890B GC-System in
Verbindung mit einem Agilent GC/Q-TOF-System der Serie 7200
durchgeführt. Die Gerätebedingungen sind in Tabelle 1 gelistet
und die Gerätesystemkonfiguration ist in Abbildung 1 gezeigt.
Probenvorbereitung
Auf Märkten vor Ort wurden Gemüse und Obst als Proben
eingekauft. Zur Vorbereitung der matrixangepassten
Standards für Validierungszwecke wurden entsprechende
Leerwertextrakte verwendet. Auf diese Weise wurden fünf
Arten von Obst und Gemüse (Äpfel, Karotten, Porree, Tomaten
und Orangen) mit der zuvor beschriebenen QuEChERS-Methode
extrahiert [4]. Die Gemüseextrakte wurden mit dem StandardGemisch in verschiedenen Konzentrationen (10 bis 200 µg/kg)
versetzt und anschließend durch GC/Q-TOF analysiert.
2
Akquisition und Analyse der Daten
Tabelle 1: Gaschromatograph- und Massenspektrometer-Bedingungen
Zur Datenakquisition wurde die MassHunter Acquisition
Software B.07.02 verwendet. Die Datenanalyse für das
Pestizid-Screening wurde mit dem All Ions-Tool in der
MassHunter Qualitative Analysis-Software (B.07.00) und der
GC/Q-TOF Pestizid-PCDL (Best.-Nr. G3892A) durchgeführt.
Zur Datenanalyse für die Pestizidquantifizierung wurde die
MassHunter Quantitative Analysis-Software (B.07.01) verwendet.
GC-Bedingungen
Säulen Agilent HP-5MS Ultra Inert,
15,0 m × 0,25 mm, 0,25 µm
(Best.-Nr. 19091S-431UI)
Einlass Multimode-Einlass,
Auslass Druckgesteuertes T-Stück
Agilent HP-5MSUI,
15,0 m × 0,25 mm, 0,25 µm
(Best.-Nr. 19091S-431UI)
Einlass Druckgesteuertes T-Stück
Auslass Vakuum
Ergebnisse und Diskussion
EinspritzblockMultimode-Einlass
Das All Ions-Tool
InjektionsmodusSplitless
Injektionsvolumen
1,0 µl
Einspritzblock-Liner Ultra Inert Liner, split, gerade, Glaswolle
(5190-2293)
Trägergas
Helium mit konstantem Fluss von 0,96 ml/min
Ofenprogramm
1 Minute bei 60 °C
40 °C/min bis 120 °C, 0 Minuten
5 °C/min bis 310 °C, 0 Minuten
Retention Time Locking Locking von Chlorpyrifos-methyl zu 18,111
Minuten
Backflush Nachlaufzeit, 5 Minuten, Ofen 300 °C
40 psi am druckgesteuerten T-Stück, Einlass
1 psi
Transferlinientemperatur 280 °C
Die Datenanalyse wurde mit der MassHunter Qualitative
Analysis-Software (B.07.00) durchgeführt. Der Anwender
kann die Parameter für die All Ions MS-Technik in einem
neuen Tab mit der Bezeichnung „Fragment Confirmation“
(Fragmentbestätigung) im Bereich „Find by Formula“
(FbF; „nach Formel suchen“) der MassHunter Qualitative
Analysis einstellen (Abbildung 2). Über diesen Tab kann
festgelegt werden, wie viele der Ionen mit der größten
Spezifität extrahiert werden sollen. Außerdem lassen sich
Grenzwerte für extrahierte Ionenchromatogramme (EIC)
von Fragment-Ionen auf der Basis von Differenzen in der
Retentionszeit (RT), des minimalen Signal/Rauschen (S/N)Verhältnisses und des Koelutionsscores einstellen. Die EICs
der EI-Fragmente mit der größten Spezifität in jedem PCDLSpektrum werden extrahiert und anhand eines speziellen
Koelutionsscore-Parameters evaluiert. Der Koelutionsscore
wurde mithilfe einer Technik ermittelt, die Ähnlichkeit
mit der Methode zur Ermittlung der Peak-Reinheit bei der
UV-Chromatographie aufweist [1] und bei der mehrere
Faktoren in die Wertberechnung einfließen, beispielsweise
Abundanz, Peakform (Symmetrie), Peakbreite und RT.
Abbildung 3A zeigt beispielhaft überlagerte EICs für Ionen aus
Bupirimat in Karottenextrakt. Alle Ionen zeigen den gleichen
chromatographischen Apex und die gleiche Form, was nahe
legt, dass sie aus derselben Verbindung stammten. Die
normalisierten Quotienten aus der Intensität der FragmentIonen zu der Intensität des Referenzions werden über die
gesamte RT geplottet und dem Anwender zur Prüfung in
einem Koelutionsplot zur Verfügung gestellt (Abbildung 3B).
Wenn alle Ionen wie in diesem Beispiel in der Mitte des
Referenzionenpeaks einen Quotienten von ungefähr 1
aufweisen, kann dies als starker Nachweis dafür betrachtet
werden, dass die Fragmente zur selben Verbindung gehören.
Q-TOF MS-Bedingungen
Gerät
Agilent 7200 Q-TOF
IonisationsmodusEI
MS-Temperaturen
Quelle 280 °C, Quadrupol 150 °C
Detektions-Modus45–550 m/z Scan
Spektrenerfassungsrate
5 Spektren/s
Aux EPC
Multimode
Injektor
Purged
Ultimate
Union
Agilent 7200
Q-TOF
EI-Modus
Agilent 15-m HP-5ms
(0,25 mm ID × 0,25 µm)
Agilent 15-m HP-5ms
(0,25 mm ID × 0,25 µm)
Abbildung 1. GC/Q-TOF-Konfiguration mit Backflush in der Säulenmitte
3
Counts (%)
Abbildung 2. Tab „Fragment Confirmation“ des Tools „Find by Formula“ (FbF)
in der Agilent MassHunter Qualitative Analysis-Software
1,1
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Quotient Fragment-Ion/Vorläufer-Ion
10
8
6
A
24,043
23,80
23,85
23,90
23,95
24,00
24,05
24,10
Erfassungszeit (Min)
24,15
24,20
24,25
24,30
24,35
23,80
23,85
23,90
23,95
24,00
24,05
24,10
Erfassungszeit (Min)
24,15
24,20
24,25
24,30
24,35
B
4
2
0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,1
0,08
Abbildung 3. Überlagerte EICs für Bupirimat in Karottenextrakt mit dem Referenzion in grau und Qualifizierionen in anderen Farben. Alle
Ionen weisen denselben chromatographischen Apex (A) und dasselbe berechnete Koelutionsplot (B) auf. Alle FragmentIonen weisen in der Mitte des Referenzpeaks Quotienten von ungefähr 1 auf, was auf starke Koelution hindeutet. Dies
bestätigte die Identifizierung von Bupirimat in der Probe.
4
Anzeige von Verbindungsdetails
einmal isoliert dargestellt und zeigt die gemessene Masse
und die Retentionszeit sowie die Ziel- bzw. Referenzwerte
und die Identifizierungsscores. Durch die Flexibilität der
Einstellungen des All Ions-Tools hat der Anwender über die
Auswahl der gewünschten Anzahl qualifizierender Ionen,
des Koelutionsscores, des Massenextraktionsfensters und
anderer Parameter die Möglichkeit der Feinabstimmung auf
die jeweilige Applikation (Abbildung 2). Das RT-Locking sorgt
darüber hinaus für präzise Identifizierung der Pestizide.
Der Anwender kann durch alle Verbindungen auf dem
Bildschirm scrollen und sich für jede Verbindung die
überlagerten EIC, den Koelutionsplot, Spektrumergebnisse
und die Identifizierungsparameter, in diesem Fall für
Bupirimat, effizient anzeigen lassen und damit die
Ergebnisse schnell überprüfen (Abbildung 4). Das Panel
mit den Identifizierungsparametern ist in Abbildung 5 noch
Abbildung 4. Überblick über Ergebnisse mit dem Agilent All Ions-Tool für mit Pestiziden versetzten Karottenextrakt
Abbildung 5. Fenster im Agilent All Ions-Tool mit identifizierten Verbindungen
5
Quantitative Analyse
Zur Validierung wurden fünf verschiedene Matrices (Äpfel,
Karotten, Tomaten, Porree und Orangen) mit 56 Pestiziden in
steigenden Konzentrationen versetzt (Tabelle 2). Die meisten
Verbindungen wurden in allen Matrices in der niedrigsten
zugesetzten Konzentration von 10 µg/ml (parts per billion,
(ppb)) detektiert, und ihr Vorhandensein wurde durch
mindestens zwei zusätzliche Fragment-Ionen (dunkelgrüne
Felder) und deren Retentionszeiten verifiziert.
Im Falle der Detektion unerwarteter Verbindungen kann eine
anschließende quantitative Analyse erforderlich werden.
Dazu lassen sich die qualitativen Daten einfach in einer Datei
im Compound Exchange-Format (CEF) in die MassHunter
Quantitative Analysis-Software exportieren.
Tabelle 2: Ergebnisse des Verbindungsscreenings in fünf Matrices (10 bis 200 ppb)
Verbindung
Tomaten
10 50 100 200
Karotten
10 50 100 200
Äpfel
10 50 100 200
Orangen
10 50 100 200
Porree
10 50 100 200
Dichlorvos
Biphenyl
Phenylphenol 2Chlorpropham
Trifluralin
HCH alpha
HCB
HCH beta
Propazin
HCH gamma (Lindan)
Terbuthylazin
Pyrimethanil
Diazinon
Pirimicarb
Chlorpyrifos-methyl
Parathion-methyl
Vinclozolin
Tolclofos-methyl
Metalaxyl
Fenpropidin
Fenitrothion
Chlorpyrifos
Fenpropimorph
Pendimethalin
Fipronil
Procymidon
Endosulfan alpha
Dieldrin
DDE p,p’Myclobutanil
Bupirimat
Kresoxim-methyl
Endosulfan beta
Chlorobenzilat
DDD p,p’DDT o,p’Oxadixyl
Weiß = nicht gefunden; dunkelgrün = gefunden; hellgrün = gefunden, für die Quantifizierung verwendetes Qualifizierion
6
Tabelle 2: Ergebnisse des Verbindungsscreenings in vier Matrices (10 bis 200 ppb) (Fortsetzung)
Verbindung
Tomaten
10 50 100 200
Karotten
10 50 100 200
Äpfel
10 50 100 200
Orangen
10 50 100 200
Porree
10 50 100 200
Endosulfansulfat
DDT p,p’TPP
Iprodion
Tetramethrin I
Bromopropylat
Tetramethrin II
Bifenthrin
g-Cyhalothrin
Acrinathrin
Bitertanol
Cypermethrin I
Cypermethrin II
Etofenprox
Esfenvalerat (SS,RR)
Azoxystrobin
Weiß = nicht gefunden; dunkelgrün = gefunden; hellgrün = gefunden, für die Quantifizierung verwendetes Qualifizierion
Diese CEF-Datei enthält die zur Konfiguration einer
quantitativen Methode erforderlichen Informationen: Name
der Verbindung, Retentionszeit, Referenzion, Fragment-Ionen
(zur Erstellung von Qualifizierionen) und relative Abundanzen.
Die MassHunter Quantitative Analysis-Software wählt die
Referenz- und Qualifizierionen automatisch und macht
eine aufwändige manuelle Verarbeitung damit überflüssig.
Nachdem die Methode konfiguriert ist, können die
entsprechenden Proben quantitativ analysiert werden. Durch
die applikationsbereite Automation kann MassHunter Daten
sowohl erfassen als auch quantifizieren und erstellt einen
Bericht über die Zielverbindungen.
A
24,031 min
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
×102
Relative Abundanz (%)
Counts
×104
23,6 23,7 23,8 23,9 24,0 24,1 24,2 24,3 24,4
Erfassungszeit (Min)
1,2
1,1
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Seit langem stellt MassHunter eine beliebte Plattform
zur Überprüfung quantitativer Ergebnisse dar, und diese
Softwaretools stehen auch für die GC/Q-TOF zur Verfügung. In
diesem Fall ermöglicht die Quantitative Analysis-Software die
Anzeige von Quantifizier- und von Qualifizierionen, aber mit noch
höherer Ergebniszuverlässigkeit durch Einstufung der Qualität
der Identifikationen mit akkuraten Massefaktoren. Abbildung
6 zeigt extrahierte Ionenchromatogramme von Bupirimat mit
zwei Qualifizierionen und deren Quotienten, die gegen das
Quantifizierion aufgetragen wurden. Bei der Datenverarbeitung
markiert die MassHunter Quantitative Analysis-Software
automatisch solche Qualifizierionen-Quotienten, die außerhalb
der vom Anwender festgelegten Grenzwerte liegen.
B
208,1458; 316,1564; 273,1016
Quotient = 30,6 (111,4 %)
Quotient = 93,1 (100,3 %)
23,6 23,7 23,8 23,9 24,0 24,1 24,2 24,3 24,4
Erfassungszeit (Min)
Abbildung 6. EICs des Quantifizierions (Zielions) (A) sowie Qualifizierionen und erwarteter Quotient von Qualifizier- zu
Quantifizierion (B) für Bupirimat in Apfelextrakt bei 10 µg/ml (ppb).
7
Bei den meisten Verbindungen liegt der erforderliche
Kalibrierungsbereich in der Regel zwischen 10 und 200 ng/ml.
Wenn viele Verbindungen in derselben Analyse quantifiziert
werden sollen, ist davon auszugehen, dass manche
Verbindungen eine viel höhere Response hervorbringen als
andere. Bei solchen Verbindungen kann dies zur Sättigung
des höchsten Kalibrierungsstandards von 200 µg/ml
führen. Mit GC/Q-TOF lassen sich Response-Faktoren
problemlos vereinheitlichen, weil EI häufig ein Spektrum
von Kandidatenionen zur Auswahl anbietet. Die Auflösung
des Massenspektrometers ermöglicht auch die Verwendung
von Kohlenstoff-13-Isotop-Ionen. Damit kann der Anwender
einfach das Ion auswählen, das für den Kalibrierungsbereich
optimal ist, es aufgrund der nicht-zielspezifischen Art der
Akquisition mit einem GC/Q-TOF aber auch nachträglich
wieder ändern. Nachträgliche Analysen sind genau das, was
benötigt wird, wenn eine quantitative Methode mithilfe von
Anreicherungen und Standards erstmals angewendet wird.
Auch dies bildete einen Teil der Zielsetzung der vorliegenden
Studie. Die Ergebnisse werden in einem separaten Bericht
vorgestellt. In Tabelle 2 (hellgrüne Felder) sind vorerst jene
Verbindungen gezeigt, deren Quantifizierung durch die
Anpassung weg von den dominanten Ionen profitierte.
Schlussfolgerungen
Das Agilent GC/Q-TOF der Serie 7200 in Verbindung mit
der Agilent MassHunter Qualitative Analysis-Software
und der GC/Q-TOF Pestizid-PCDL ermöglicht ein effektives
Screening auf Pestizidrückstände in verschiedenen Matrices
in Konzentrationen von nur 10 ppb. Die Anwendung des
speziellen Agilent All Ions-Tools sorgt für eine genaue
Identifizierung. Zu den Vorteilen der Anwendung von
GC/Q-TOF zählen die höhere Zuverlässigkeit bei der
Bestätigung der Verbindungen durch hochauflösende,
massengenaue Daten, die Fähigkeit zur Durchführung einer
nachträglichen Analyse (insbesondere bei unerwarteten
Peaks) und die Möglichkeit des nahtlosen Übergangs von der
qualitativen zur quantitativen Analyse.
Diese Ergebnisse sind vielversprechend, weil es damit nicht
nur möglich wird, Daten aus der Vergangenheit erneut zu
analysieren, wenn neue Verbindungen für ein Labor relevant
werden, sondern weil damit auch ein Mittel zur Verfügung
steht, optimierte quantitative Methoden zu erstellen und
künftig zu erweitern.
Literatur
1. SANCO/12571/2013. Guidance document on analytical
quality control and validation procedures for pesticide
residues analysis in food and feed, 2013.
2. V. Giarrocco, B. Quimby, M. Klee, Retention Time Locking:
Concepts and Applications, Agilent Technologies
Application Note, Publikationsnummer 5966-2469EN,
Dezember 1997.
3. H. Prest, Capillary Flow Technology for GC/MS: A Simple
Tee Configuration for Analysis at Trace Concentrations
with Rapid Backflushing for Matrix Elimination,
Agilent Technologies Application Note,
Publikationsnummer 5979-8664EN, Juni 2008.
4. L. Rajski, et al. „Comparison of three multiresidue methods
to analyse pesticides in green tea with liquid and gas
chromatography/tandem mass spectrometry“ Analyst,
138, 921-931 (2013).
5. H. P. Sievert, A. C. J. H. Drouen. „Spectral matching and
peak purity in Diode Array Detection“ in High Performance
Liquid Chromatography, New York, Marcel Dekker, 51,
(1993). Weitere Informationen
Diese Daten stellen typische Ergebnisse dar. Weitere
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www.agilent.com/chem
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Gedruckt in den USA
9. Februar 2016
5991-5894DEE

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