Signalsequenzen binden an Transportproteine (Rezeptoren) dadurch wird Weg des Proteintransports in der Zelle festgelegt - + ausgedehnter hydrophober Bereich Proteinimport in Zellkern: PPKKKRL Proteinimport in ER: MMSFVSLLLVGILFWATEAEQLLTKCEVFQ Retention im ER: KDQL Proteinimport in Mitochondrien: MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL Proteinimport in Peroxisomen: SKL Import in Zellkern findet über Kernporen statt im Gefrierbruch sichtbare „Verbindungskanäle“ zwischen ZellkernCytoplasma Schematische Darstellung Kernpore Import Kernproteine Kernpore: aus ca. 100 verschiedenen Proteinen bestehende komplizierte Struktur annuläre luminale säulenförmige ringförmige Untereinheit Cytosol Nucleus ER, Ribosomen und Proteinlokalisation in der lebenden Zelle Freie Ribosomen cytosolische Proteine Hämoglobin Polyribosomen Proteinlokalisation in Zelle Glycoproteine Membranproteine sekretorische Proteine rauhes ER Anordnung als freie oder am ER gebundene Ribosomen hängt von Anwesenheit von Signalsequenzen in translatierter mRNA ab Zellkern und Endoplasmatisches Reticulum (ER) Lenkung cytosolischer bzw. sekretorischer Proteine Proteinlokalisation in Endoplasmatisches Reticulum (ER) Lokalisation in ER-Lumen: sekretorische und Membranproteine Glycoproteine, Lipoproteine Proteolytische Prozessierung Transmembranprotein Verankerung eines Transmembrananteils in Membran stop start Signalsequenzen eukaryotischer sekretorischer Proteine basisch basisch hydrophob Kovalente Modifizierung im ER Proteinmport in Mitochondrien Chaperone: Protein-Entfaltung vor Import in Mitochondrien und Chaperon (Hsp70)-vermittelte Faltung Protein-Qualitätskontrolle beim Austritt aus ER: Chaperone Chaperone - verhindern Aggregation - entfalten fasch gefaltete Proteine - helfen Proteine zu entfalten, welche durch biologische Membranen zu transportieren sind Dyctiosom Vesikelabschnürung aus Golgi-Zisternen Transportvesikel raues ER Sekretvesikel Proteinmodifizierung zu Lipoproteinen (lp) glattes ER (ger) und Golgi anschl. Exocytose in Sekretvesikeln (sv) Golgi-Apparat als Verschiebebahnof und Endfertigung der Zelle Liganden- bzw. Antikörper-gekoppelte Fluoreszenzmarker Signalamplifikation mittels Sekundärantikörper ER -> Golgi -> Zellmembran ER-> Golgi-> Endosom -> Lysosom Nach kurzfristigem Angebot radioaktiv markierter Aminosäure (pulse-chase) Enzymhistochemie: Lichtmikroskop Enzymcytochemie: Elektronenmikroskop Fraktionierung Zellorganellen in Ultrazentrifuge Direkte Beobachtung der Fraktionen im Transmissions-EM Enzymbestimmungen (Markerenzyme für Organellen) in situ Lokalisierung des Enzyms Identifizierung organspezifischer Proteine mit spezifisch bindenden Liganden oder Antikörpern (Fluoreszenz-, Goldpartikel-) „leichte“ und „schwere“ Lysosomen mit Detergens bzw. kolloidalen Gold Zellfraktionierung und Enzymlokalisation Leitenzyme der Zellorganellen • • • • • • • • • Zellmembran: Na+/K+ ATPase Zellkern: DNA- bzw. RNA-Polymerase Cytosol: Enzyme der Glycolyse sER: Hydroxylierungsenzyme rER: ribosomale Proteine Golgi: Galactosyl-Transferase Lysosomen: saure Phosphatase Peroxisomen: Katalase Mitochondrien: Cytochrom c-Oxidase Exocytose (Trans-Golgi-Netzwerk) Endocytose (Endosom, Lysosom) Transcytose apikal basolateral wie werden Proteine an richtigen Ort in der Zelle dirigiert ? bezüglich Verbreitung in Gewebe kommt es auf Art der Zell-Zell-Verbindung an Wie können sogar Proteine ohne Signalsequenz an richtigen Ort in Zelle gelangen? Gerichteter Vesikeltransport von Donator- zu Acceptororganelle organellspezifische GProteine auch als Auslöser für Membranfusion merokrine (Exocytose) apokrine (Brustdrüse) holokrine (Talgdrüse) Sekretion Exocytose: konstitutiv bzw. getriggert Immunogold-Lokalisierung Sialinsäure-Transferase im Golgi-Apparat Konstitutive und getriggerte (regulierte) Sekretion Exocytose sekretorischer Vesikel hochkonzentriertes, sofort freisetzbares Insulin (stimuliert Glucoseaufnahme) Mastzelle vor (li) und nach (re) Triggerung und Freisetzung von Histamin Trennung Motoneuron (nz) von Muskelzelle (mz) durch synaptischen Spalt (ss) praesynaptische (prm) postsynaptische (pom) sec. Membran neural Neurotransmitter-Vesikel min. hormonell Koppelung Endocytose/Exocytose Entkoppelung von Ligand- und Rezeptorkreislauf „Stachelgrübchen“ „Stachelvesikel“ Clathrin-vermittelte Endocytose Phagocytose als Spezialfall der Endocytose Rezeptorvermittelte Endocytose von Cargomolekülen Clathrin-coated pits an Zellmembran ->Clathrin-coated vesicles in Zytoplasma ->Vesikelbildung mit H+ Pumpe -> frühes Endosom -> Lysosom Goldpartikel Compartment of Uncoupling Receptor-Ligand Endocytose Flüssigkeit (Pinocytose) Partikel, größeres Molekül (rezeptorvermittelt) Phagocytose Bakterien, Parasiten Phagocytose Erythrocyt durch Makrophagen Phagocytose von Bakterien durch Makrophagen Phagocytose Bakterium durch Leukocyten Lysosomen: Orte hydrolytischen Abbaus in Zellen Enzymcytochemische Lokalisierung saurer Phosphatase in Lysosomen Aktivität Saure Phosphatase in (nicht allen s. *) Lysosomen aber auch in Vesikel des Golgi-Bereichs Mannose-6-P: Lokalisierungssignal für Lysosomen Lysosomen aufgrund räumlicher Nähe zum Golgi als primäre Lysosomen? jedoch direkter Nachweis: „wer fusionierte in welcher Reihenfolge mit wem?“ ist problematisch Nachweis: „wo und wie genau“ jedoch nicht immer unproblematisch primäres Lysosom: Transportvesikel von Trans-Golgi sekundäres Lysosom: Mit Auto- oder HeteroPhagosomen fusioniertes primäres Lysosom tertiäres Lysosom: Autophagosome und heterophagosome Partikel bzw. Abbauprodukte davon enthaltend (Konfluenz) Heterophagie Konfluenz Autophagie Autophagie (Abbau Mitochondrium) a: teilw. Von ER-Cisterne umschlossenes Mitochondrium b: von einfach- bzw. Doppelmembran umschlossenes Mitochondrium c: als ehem. Mitochondrium nur noch vage zu erkennen bzw. zu „erahnen“ Beweis: Konfluenz Autophagie mit Heterophagie Endosom mit Mitochondrium, gleichzeitig Goldpartikel von Endocytose enthaltend Aufgrund saurer Phosphatase-Aktivität als Pb3(PO4)2 : Identifizierung als Lysosom Pflanzliche Vakuole als „Riesenlysosom“ Hypervariabilität Zellorganellen
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