Diabetes, 2010, January Hyperglycemia-Induced Reactive Oxygen Species Increase Expression of the Receptor for Advanced Glycation End Products (RAGE) and RAGE Ligands 高血糖により誘導される活性酸素種はRAGEと RAGEリガンドの発現を増加させる 2015/01/05 M1 瀧井靖歩 背景と目的 高血糖状態ではミトコンドリアの電子伝達系においてROS産生が増加する。 (Diabetes, 2005) 高血糖により誘導されたROSが細胞内でのAGEs産生を促進する。 (Nature, 2001) High Glucose ROS ？ RAGE ？ RAGE Ligand AGEs 高血糖により誘導されるROSがRAGEおよびRAGEリガンドの発現に 与える影響を評価した。 高血糖によるROS産生のメカニズム High Glucose ROS GAPDH H+ H+ H+ Ⅰ e- Ⅲ e- Ⅳ CoQ Ⅱ e- AGEs H+ H+ Cyt C eFADH2 FAD NAD+ NADH + H+ H2O O2 ATP ADP+Pi ATP synthase Heat UCP-1 高血糖によるROS産生のメカニズム High Glucose ROS GAPDH H+ H+ H+ Ⅰ e- Ⅲ e- Ⅳ CoQ Ⅱ e- AGEs H+ H+ Cyt C eFADH2 H2O FAD NAD+ NADH + H+ H2O+O2 eMn-SOD ・ー O2 O2 ATP ADP+Pi O2 ATP synthase Heat UCP-1 ROSによるAGEs産生増加のメカニズム PARP : poly(ADP-ribose) polymerase ADPR : ADP ribose NA : nicotinic acid High Glucose High Glucose ROS ROS DNA GAPDH PARP ADPR AGEs NAD+ NA GAPDH GAPDH ROSによるAGEs産生増加のメカニズム High Glucose Glucose Glucose-6-P ROS GLO1 (Glyoxalase 1) α-オキソアルデヒドを分解する 酵素。 Methylglyoxal (MG) H CH3 O O Fructose-6-P GAPDH GLO1 Glycelaldehyde-3P AGEs Methylglyoxal ↑ →AGEs ↑ NAD+ GAPDH NADH 1,3-Bisphosphoglycerate 背景と目的 高血糖状態ではミトコンドリアの電子伝達系においてROS産生が増加する。 (Diabetes, 2005) 高血糖により誘導されたROSが細胞内でのAGEs産生を促進する。 (Nature, 2001) 転写因子SP3のコリプレッサーであるmSin3AのMG修飾が、血管内皮細胞における Angiopoietin2の発現を促進する。 (J. Biol. Chem., 2007) High Glucose High Glucose ROS MG ？ RAGE ？ RAGE Ligand mSin3A AGEs SP3 MG-mSin3A Angiopoietin2 高血糖により誘導されるROSがRAGEおよびRAGEリガンドの発現に 与える影響を評価した。 高血糖がRAGEとRAGEリガンドの発現に与える影響 ヒト大動脈内皮細胞 (HAEC)を低／高グルコース 下で5日間培養 (A) RT-PCR, (B)ウェスタンブロットを用いて、 RAGEおよびRAGEリガンドの発現量を評価 Low Glucose (LG) → 5 mM, High Glucose (HG) → 30 mM HGでRAGEとRAGEリガンドの発現が促進した 高血糖がRAGEとRAGEリガンドの発現に与える影響 HAECをLG/HGで5日間培養 培養上清中のHMGB1をELISAで定量 HGでRAGEリガンドの発現が促進 した 高血糖がROS産生に与える影響 HAECをLG/HGで5日間培養 細胞内ROS産生量をCM-H2DCFDAを 用いて定量 HGでROS産生が促進 → UCP1, SOD2, GLO1過剰発現により抑制された 高血糖が細胞内でのAGEsの形成に与える影響 HAECをLG/HGで5日間培養 細胞内メチルグリオキサール (MG)AGEsをウェスタンブロットにて定量 HGでAGEs産生が促進 → UCP1, SOD2, GLO1過剰発現により抑制された 高血糖がGLO1の活性と発現に与える影響 HAECをLG/HGで D-F) 24時間培養 G-I) 5日間培養 Glyoxalase1 (GLO1)の活性と タンパク質発現量を評価 HGでGLO1の活性と発現が抑制→UCP1, SOD2, GLO1過剰発現により改善 RAGEとRAGEリガンドの発現にGLO1が与える影響 HAECにshRNAを導入し GLO1をノックダウン LG/HGで 5日間培養 (A) RT-PCR, (B)ウェスタンブロットを用いて、 RAGEおよびRAGEリガンドの発現量を評価 GLO1ノックダウンによって、RAGEおよびRAGEリガンドの発現が上昇した 細胞内でのAGEsの形成にGLO1が与える影響 HAECにshRNAを導入し GLO1をノックダウン LG/HGで 5日間培養 細胞内メチルグリオキサール (MG)AGEsをウェスタンブロットにて定量 GLO1ノックダウンによって、細胞内でのAGEs産生が促進した NF-κBとGLO1がRAGEの発現に与える影響 HAECにsiRNAを導入し NF-κB p65をノックダウン LG/HGで 5日間培養 RAGE発現量をRT-PCRで評価 NF-κB p65ノックダウンによって、HG下でのRAGEの発現上昇が抑制された NF-κBとGLO1がRAGEの発現に与える影響 HAECにアデノウイルスベクター を導入しGLO1を過剰発現 LG/HGで 5日間培養 NF-κB p65特異的抗体で クロマチン免疫沈降した後、 RAGEプロモーター配列を RT-PCRにて定量 クロマチン免疫沈降 (ChIP)について GLO1の過剰発現によってHG下でのNF-κBのRAGEプロモーター領域への結合が 抑制された AP-1とGLO1がRAGEリガンドの発現に与える影響 HAECを用いて、 C) AP-1をノックダウン D) GLO1を過剰発現 LG/HGで 5日間培養 C) RAGE リガンド発現量を評価 D) AP-1とRAGEリガンド プロモーター領域の結合を評価 AP-1ノックダウンによって、HG下でのRAGEリガンドの発現上昇が抑制された GLO1の過剰発現によって、HG下でのAP-1のRAGEリガンドプロモーター領域 への結合が抑制された C57/BL6マウスからの細胞の単離 C57/BL6マウスの大動脈組織から、 Laser Capture Microdissection (LCM)法を用いて、血管内皮細胞 と血管平滑筋細胞を単離 A) vWF (血管内皮細胞のマーカー) B) α-actin (血管平滑筋細胞のマーカー) の遺伝子発現をRT-PCRにて評価 組織中から、血管内皮細胞と血管平滑筋細胞が単離されたことが確認された マウスにおけるROS産生およびAGEs産生にMnTBAPが与える影響 C57/BL6マウス WT STZ STZ/MnTBAP 5 days 4 weeks Vehicle STZ STZ 7 days Vehicle Vehicle MnTBAP C,D) 3-nitrotyrosineを定量 E,F) MG-AGEsを定量 MnTBAP :SOD様活性を有するMn複合体酵素 糖尿病によって促進されるROS産生およびAGEs産生がMnTBAPによって改善した マウスの大動脈内皮細胞におけるRAGEおよび内因性RAGEリガンド の発現にMnTBAPが与える影響 マウスの大動脈から 血管内皮細胞を単離 RAGEおよびRAGEリガンドのmRNA発現を評価 糖尿病によって促進される血管内皮細胞でのRAGEおよびRAGEリガンド発現が MnTBAPによって改善した まとめ High Glucose ROS MG GLO1 MG-AGEs NF-κB AP-1 高血糖により誘導されるROSが RAGE RAGEリガンド の発現を促進した。 RAGE RAGE Ligand GLO1が このメカニズムに対して、 抑制的に働くことが示された。 High Glucose ROS MG GLO1 (Mit) MG-AGEs NF-κB RAGE ROS AP-1 RAGE Ligand (Nox) RAGEについて RAGE (Receptor for Advanced Glycation End Products) ● AGEs (Advanced Glycation End Products, 最終糖化産物)の受容体として発見された、 膜貫通型レセプター。 ● AGEs以外にも内因性のタンパク質もリガンドとして認識する。 ● リガンド結合により、炎症やアポトーシスなど様々な反応を誘導する。 ● 細胞内ドメインがmDia-1と相互作用することにより、シグナルを伝達する。 ( J. Biol. Chem., 2008) Ligand RAGE mDia-1 シグナル伝達 RAGEリガンドについて AGEs CML 還元糖とタンパク質などのアミノ基の反応により生成する。 O OH C 還元糖 ＋ タンパク質 AGEs HN CH2 Lys non-AGEs ligand HMGB-1 (High Mobility Group Box 1) p53やNF-κBなどの転写因子の機能発現に関わるDNA結合タンパク質。 マクロファージや壊死細胞から放出され、RAGEやTLRのリガンドとして作用する。 S100ファミリータンパク質 脊椎動物に特有のタンパク質。カルシウム結合ドメインを持ち、細胞内カルシウ ムイオン濃度を一定に保つバッファーとして働く。
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