T-RFLP法による複合微生物群集解析方法の開発
誌名
千葉県産業支援技術研究所研究報告 = Reports of Chiba Industrial
Technology Research Institute
ISSN
13488457
著者
岡, 千寿
飯嶋, 直人
巻/号
6号
掲載ページ
p. 19-23
発行年月
2008年10月
農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波事務所
Tsukuba Office, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat
千葉県産業支援技術研究所研究報告 N
o
.
6(
2
0
0
8
)
T
R
F
L
P法による複合微生物群集解析方法の開発
バ イ オ 応 用 室 岡 千 寿 ，飯 嶋 直 人
Developmento
fEvaluationf
o
rMolecularI
d
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n
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i
f
i
c
a
t
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o
no
fBacteriaBasedonT-RFLPAn
a
l
y
s
i
s
I
]
IMA
C
h
i
t
o
s
h
iOKAandNaotoI
食酢製造における，木桶もろみと玄米酢もろみを T-R
FLP法により解析した。 木桶もろみは
開放系にもかかわらず，極めて純粋培養に近く ，A
. pasteurianusが主要な菌種であった。
一方，玄米酢もろみでは A
. pasteurianusの他に ， L
. acetotoleransが発酵の初期から
中期にかけて旺盛に活動してしていることが明らかとなった。 さらに， 1
6S-23S I
T
S 領域の
塩基配列のわずかな違いを利用して菌株レベノレで、の解析を行い，玄米酢もろみでは，木桶も
. pasteurianusの菌株が存在していることがわかった。
ろみとは異なる A
1.はじめに
xylinuss
p. を実験に供した。
T-RFLP
工
(erminal Restriction Fragment
1engthEolymorphism)法は， DGGE(Qenaturing
2.2
Qradient Qel glectrophoresis)法とともに複
雑な微生物菌相の解析に用いられ，微生物の 1
6
遠心分離により，微生物菌体を回収し， QIAamp
ゲノム D
N
Aの調製
木桶もろみ，玄米酢もろみ等のサンプルから
DNA mini k
it(キアゲン社製)を用いてゲノム
DNAを調製した。
2.3 1
6
S rRNA遺伝子領域の T-RFLP解析
S rRNA遺伝子等の塩基配列の違いを利用して微
生物群集の多様性，優先種の変遷などを比較的
簡便に把握することができる方法である 。
この T-RFLP法を用いて食酢の静置発酵中での
微生物の変遷について解析を行い，木桶もろみ
と玄米酢もろみの微生物菌相について解析した
結果を報告する 。
もろみ等のサンプルから調製したゲノム DNA
を用いて 27F-D4 p
rime
r(蛍光ラベル化プライ
マー:5'-D4-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')と519R
primer(5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3
')により PCR
を行った後， PureLink PCR Purification kit
(インビトロジェン社製)により PCR産 物 を 精 製
し，適当な制限酵素で処理した。 これらのサン
1
6
Sr
悶叫 遺.
f
i
i
C
子
か幽争
ι
プノレを希釈して分子量マーカーを添加した後，
‘
圃
ー
5
1
9
R
ι
巳
コ
CEQ 8000 Genetic Analysis System(ベックマ
ン ・コーノレター社製)によりフラグメント解析
を行った(図 1)
。
2.4 1
6S-23S I
T
S 領域の解析
iPCRIこ、
よ 拘幅 ‘￨
￨制 開 索 処 理 ￨
_1
I ~ 岡田剛鵬
16S-23S I
T
S領域の解析は，ゲノム DNAを用い
4primer(蛍光ラベル化プライマー:
て 1492F-D
5'-D4-AAGTCGTAACAAGGTARCCGTA-3
'
)と22R_23S
primer (
5
'-GTGCCWAGGCATCCACCG-3')，あるい
l
-一
一 一
一
一
. i-.IIUI.lZ.L出~LL払aUムU且~
- ー ー ー 町 ー ー
-Specific primer(5'-ATCAACACCAGACATAC
は
， K
図1 1
6
S rRNA遺伝子の T-RFLP解析の概略
AAATAC-3
')を用いて PCRを行い， 1
6
S rRNA遺伝
子領域と同様に解析した。
2. 実験方法
2. 1
1
6
S rRNA遺伝子の塩基配列の決定
玄 米 酢 も ろ み か ら 調 製 し た ゲ ノ ム DNAを用い
492Rprimer(5'-TACGGYTAC
て
， 27F primer と1
CTTGTTACGACTT-3')で PCRを行い，この PCR産物
2.5
供試菌株
ペcetobactθr acθt
iNBRC 3
2
8
1，Acθ tobacter
r
pasteurianusNRIC 0
2
4
1， Cluconacetobactθ
ー
1
9-
千葉県産業支援技術研究所研究報告 NO.
6(
2008)
を pT7-Blue-tで TA ク ロ ー ニ ン グ を 行 い ， 得
られたプラスミド DNAを用いて CEQ8000 Genetic Analysis System(ベックマン ・コールタ 一
一 方 ， A. acθ t
i は全く検出されず，この企
業の 酢酸発酵 の主体は ，A
. pastθurianusが担
っていることが 推 察された(図 2'""4)。
社製)により 1
6S rRNA遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を 調 べ
27F-519R_16S
た。
木桶 6号 l
仕込み 14日目}
(27F-04)
Hpa1，
ClaId
l
g
e
s
l
l
o
n
Ap
器削向山
3. 結果及び考察
3.1
木桶もろみの
T
R
F
L
P解析
~ -:' L-…五叫斗LüI斗IIIヰill且江Ul.
まず ， A. aceti ， A
. pastθurianus 及 び
ι xylinusの
、
.
.
.I
1
6SrRNAの塩基配列を GenBanl
く
Hpa1，
A
1
uId
lgesllon
司
且ments
l
z
e 209
F
r
か ら 入 手 し，これ ら塩基配列データから菌種
F
ごとに共通の塩基配列を 作成し た。これらの菌
〆A p teurlanus
踊
種間で末端の Fragmen
t s i ze(~ 下 F . S
.と略す)
が異なる 制限酵素の組み合わせとして表 1に示
すものを選択した 。
図 2 木 桶 も ろ み (1
4日目)の T
R
F
L
P解析結果
表 1 予想されるフラグメントサイズ
27同 市 9R_16S
木緬 e
号{仕込み 37日目}
(
2
7
F
倒}
16Sr
f
小I
A遺 伝 子 (2
7F
-D4)で予想されるフラグメン卜・サイヌ
Hpa1，
ClaId
lgesllon
Hpa1 and ClaId
lgesllon
・
・
E
zm.:R・
cog.
S
・
q.
R
ゅ a1
1
CCGG
A.ace
t
J A.
p
a
s
t
e
u
r
l
a
n
u
s
11301
C旭 I : ATCGAT
~
摘 出 cut
G.x
y
l
l
n
u
s
斜2
12461
Hpa1 and A
1
uId
lgesllon
z
E
・・
Res
. m.
:R c
o
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Sq
.
Hpa1 : CCGG
A1
uI : AGCT
A.a
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J A.p
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l
a
n
u
s
[
!
司
叩
G.xy
l
l
n
u
s
州 斜2
12091
11431
実際に実験を行ってみると A
. acθ t
iNBRC
わaI
I と C
l
a
I で処理すると F
.S
.
3281では， ん
図 3 木桶もろみ
27F-519R_16S
(
3
7日目)の T
R
F
L
P解析結果
(27F
・
04)
木桶 6
号1
仕込み 47日目 l
aI
I と AluI で処理すると F.S
. 1
2
7
1
2
7， Hp
Hpa1，
ClaId
lgesllon
Fragmenls
l
z
. 442γ
の DNA断片が検出された 。
Ap
踊 t
e
u
r
l
a
n凶
A
. pasteurianusNR
IC 0241では ， Hp
aI
I と
C
l
a
I で処理すると F
.S
. 440， Hp
aI
I と Al
u
I
-L.~泊山4よヰ斗i斗il江勾i江口
で処理すると F.S. 209 の DNA断片が検出され，
ι xylinussp.で は ， 伶aI
I
、￨
と C
l
a
I で処理す
!
vl5
1
z
. 209
‘
7
Fragmt
Hpa1，
A1
uId
lgesllon
〆A p
S.246，h同 I
I と Alu
I で処理すると
ると F.
F.S. 1
4
2 の DNA断片が検出され，ほぼ予想、どお
揖 陪u
r
l
a
n国
りの結果が得られた 。
そこで，木桶もろみのサンプルについて実験
を行った 。 木桶もろみ中に存在する微生物は，
開放系であるにもかかわらず驚くほど純粋培養
図4
に近く，酢酸発酵の全ての期間をとおして A
.
木桶もろみ
(
4
7日目)の T
R
F
L
P解析結果
また ，木桶 によっては， まれに，
pasteurianus が優先種として常に検出された。
が検 出 されるものもあった(図 5)
。
-20-
ι xylinus
千葉県産業支援技術研究所研究報告 N
O.
6(
2
0
0
8
)
で処理すると F
.S
. 229となり(図 8， 9)，こ
27F519R_16S
(27F-D
仰
仕込み叫日目
Fragmentsl
z
e品 目
の 制 限 酵 素 サ イ ト を 検 索 して生じる DNA断片の
一
大きさと良く 一致した。
Ap
唱 陪u
r
l
a
n
L五njIJ
.i
i
i
i
i+
-i
ii
iI
lW
27
同 19R_16S
(27F
・凶}
L
. acθtotolerans の塩基配列
れらの結果は
崎
、
-I
二
て
木桶 6
号もろみ
27F
引 9R_16S
(27F
・
04)
玄米酢 54
号もろみ仕込み32自白
-rFragmentslz'
l
.
.
.180.
9
本 編 48
号 も ろ み 仕 込 み17日目
-1
Hpa1，
Al
uIdlges
t
l
o
n
I1IFragment剖 ze 2tO.2
二
I1I
￨
Ap
揖 桂 川an
回
t て I~白山口)江口 l ïl 日 1 1lnIIl 取 1 .
27F
5
叩 R_16S
二
T
R
F
L
P解析
t
Hpa1，A
l
uId
l
g制 l
on
、寸
Ap
制 剖r
l
a
nu
s
図 5 木桶によるちがい
玄米酢もろみの
.
1
.
玄米酢 54
号もろみ 仕 込 み46日目
Fragmen
t剖 目 210.
2
-j
3.2
(
2
7
F
0
4
)
づ姐D
五皿i
l
l
.
l
I
五l
l
l
l
l
l
i
l
l
ll
1
1
1
l
._
.
ι
1
6
S rRNA遺伝子領域で、解析を行った結果 ，玄
米酢もろみの発酵の初期から中期にかけては，
図7
H
paT
l， A
luI で処理すると A.pasteurianus
由来の F
.S
. 210 の DNA断片の 他 に F
.S
. 1
81
の主要な DNA断片が検出された(図 6， 7)。
玄米酢もろみ (
仕込み中期
27F519R_16S
(
27Fω}
後期 )
木桶 6号 もろみ 仕 込 み 1
7日目
l
o
n
Hpa1dlgest
Fragments
lze 441
.5
A pasteurlanu
s
27F519R_16S (27F
・
04)
'-E
-1
、
T
木桶 6
号もろみ仕込み1
7日目
•.
Al
uId
l
g
e
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t
l
o
n
Hpa1，
F阻 gments
i
z
e2
0
9
.
7
a
Ap
括 t
eurlanus
27F
引 9R_16S
(27F
・
04)
玄米酢 54
号もろみ 仕込み 1
5日目
H匝a1dlgestlon
てし」函日:
t
i
l
I
i
J
lUUliT
IIii
IIJll1iUi
27同 柑 R_16S (27F
・
ω}
Fra
gmen
t5
1
z
e 441.
5
玄米酢 54
号 も ろ み 仕込み 1
5日目
Hpa1，
Al
uIdlge
剖l
o
n
1
~f~]IlnHlMHnnll由日 ー
図 8 玄米酢もろみの T
R
F
L
P解析 (
H
p
aI)
27同 19R_16S
図 6 木桶もろみと玄米酢もろみの違い
(27F
・
04)
F旧日 men
t5
1ze 209.
7
本桶 6号もろみ 仕込み 1
7日目
l
o
n
AluIdlge5t
ー
ー
・ lA p
揖 担u
r
l
anus T
-<
この DNA断片の由来を調べるために ， 玄米酢
もろみの仕込み 1
5日目のサンプノレから 1
6S rRNA
遺伝子を PCRで増幅し，この PCR産物を TAクロー
、￨
三L耐
27F
・
519R
_16S
ニングしてプラスミド DNAを調製し， 2
7
F
"
'
'
51
9R
ïÏïh ïï ï I 山口江山工山JIL...~
牟i
(27F-04)
玄米酢 54
号もろみ 仕込み 1
5日目
の領域の塩基配列を調べた 。
得られたクローンは
2つのグループに分け
られ
， Blast 検索の結果 ， A.pastθu
rianus と
Lact
o
b
acillus acetotolerans であることが
わかった 。 ム acetotole
rans 由来の 1
6S rRNA
遺伝子は ， HpaT
lで処理すると F
.S
. 1
8
，
1 Alu
I
-2
1-
図9
玄米酢もろみの T
R
F
L
P解 析 は /u1
)
千葉県産業支援技術研究所研究報告 NO.
6(
2008)
また， 16S-23S ITS領 域 1)2)の T-RFLP解析の
L
. acet
ot
o
lera
ns は
つぼ造り黒酢の製造
. pasteurianus と共存する
工程においても A
c
I
T，Ha
e皿で
結果から，玄米酢もろみでは，ペ c
処理すると， F
.S
.3
3
9の A
. pasteur
ianusの
DNA断片の他に F
.S
. 300 の DNA断片が検出さ
れ，これは L
. acetotolθrans 由来のものであ
かたちでその存在が報告されており ペ 木桶も
ろみでは検出されなかったことから，おそらく
玄米麹由来で，その糖化工程，アルコーノレ発酵
0
)。
ると思われたれた(図 1
を経て増殖してきたものであると思われる 。
1
4
9
2
F
2
2
R2
3
5 (
1
4
9
2
F
D4)
3.3 玄米酢もろみにおける K株の検出
本桶暗号もるみ仕込み 1
7日目
K株は，玄米酢もろみか ら分離された通常の
N
o.1
3
3 株)とは異なる菌株として分
優良菌株 (
6
S rRNA遺伝子の塩基配列の
離されたもので， 1
. pasteurianusであることが
検索結果から ，A
fて
-
1
4
9
2
F
・2
2R_235 (
1
4
9
2
F
心4
)
わかった 。
しかし， 1
6S-23S ITS領域の塩基配列を比較
玄 米 .54
号もろみ仕込み 1
5日B
Acc1，
Hae川 d
l
ges
t
lon
して みると ，木桶もろみか ら分離された優良菌
株 (
N
o.133 株)等とはわずかに異なること が
4
F
r
a
g
m
e
n
t5
i
z
e3
3
9.
1
)。
明らかとなった(図 1
2に示すような K株に特異的なプ
さらに，図 1
ライマー (K-Specific)を用いることで，もろみ
中に存在する K株のみを検出できることを確認
図1
0 16S-23S I
T
S領域の T-RFLP解析
3
)。
した(図 1
T
∞A
A
∞AGI?I.蹴T
O
O
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T
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16S
23SITS領域の塩基配列の比較
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S領域の菌株による塩基配列の違い
-22-
NRIC0241株
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株
K株
千葉県産業支援技術研究所研究報告 NO.
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)
一方，玄米酢もろみをこの特異的プライマー
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領爆の特異的フライマーによる解析
酸発酵の全ての時期に K株が存在していること
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1
8
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で解析してみると，もろみの初期から後期の酢
235rRNA
がわかった(図 1
4， 1
5
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号もろみ仕込み32日目
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1492F
5・
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-3・
玄米酢 5
4
号 も ろ み 仕 込 削6日目
図1
2 K
株の特異的プライマーによる解析
そこで，この K株 に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー (
K
Specific)を用いて解析をしてみると，この菌
株 (K株)は，木桶もろみには存在しないこと
図1
5 K
株の特異的プライマーによる解析
がわかった(図 1
4
)。
1492F
-K5
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K"
玄米酢もろみでのみ，この K株が増殖してく
ることは今回の解析で、新たに得られた知見であ
り，仕込み原料の違い等に起因するものである
と思われる 。
4，まとめ
1)木桶もろみは，開放系にもかかわ らず純粋
_ pasteuri
加 u
sが主要な菌種
培養に近く ， A
であった。
2
) 玄米酢もろみでは，発酵の初期から中期に
_ acetoto1erans が活動している
かけて ， L
図1
3 K
株の特異的プライマーによる解析
ことが明らかとなった。
3
)1
6
S2
3
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S 領域の塩基配列のわずかな違
いを利用して，菌株レベルでの解析を行い，
1492F-KS
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1492FD4)
本桶 e
号もろみ仕込み 1
7日目
玄米酢もろみでは，木桶もろみとは異なる
菌株が存在していることがわかった。
本研究を行うにあたり，サンプルの提供，並
びに，貴重なご助言を賜りました私市醸造(株)
の 北 尚 武 氏 に 深 謝 し 、 た し ま す。
1492F
-KS
p
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(1492FD4)
玄米酢日号もろみ仕込み 1
5日目
参考文献
1
) Trcek， ]
. eta
1
. :FEMSM
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1
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8， 6
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7
5(
2
0
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2
)
.
2
) Trcek， ]
. :S
y
s
t
. バp
p
1
. Microbio1.， 28，
図1
4 K
株の特異的プライマーによる解析
7
3
5一7
4
5(
2
0
0
5
)
.
4，3
5
2
3
5
4(
2
0
0
6
)
.
3
)石井ら :生物工学会誌， 8
-23-
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