近赤外蛍光団/消光団の開発と 近赤外蛍光団 消光団の開発と 実用的蛍光プローブの創製 東京大学 大学院薬学系研究科 薬品代謝化学教室 准教授 花岡 健二郎 1 開発内容の背景 蛍光プローブ 蛍光プローブ [開発した蛍光プローブの例] Ca2+ Ca2+ + Ca2+ CaTM-2 細胞 ACIE 52 3874 (2013) 蛍光プローブとは、観測対象分子と特異的に反応あるいは相互作用し、 蛍光特性が大きく変化する機能性分子のことである。 2 2 開発内容の背景 蛍光プローブの生体応用 生命科学研究への応用例： 脳神経細胞活動の蛍光イメージング Ca2+濃度変動を可視化 Nat. Methods 8, 139 (2011)一部改 神経細胞の発火 一過性の細胞内Ca2+濃度上昇 Fluo-4 Ca2+蛍光プローブを用いることで、マウスin vivoにおける多ニューロン同時解析を 可能とする 3 開発内容の背景 代表的蛍光低分子化合物 フルオレセイン （Fluorescein） 利点： ・ 高い水溶性 ・ 高い蛍光量子収率 ・ 確立された蛍光制御機構 フルオレセイン Ex/Em = 494/521 nm ε= 80,000 cm-1M-1 応用： ・ pH指示薬 ・ 蛍光標識薬 ・ 眼底検査薬 Φ = 0.85 フルオレセインは、その優れた特性から蛍光プローブの母核として汎用さ れてきた 4 開発内容の背景 共染色への制約 Fluorescein BODIPY FL GFP (Green-fluorescent protein) (Green-fluorescent dye) (Green-fluorescent dye) 400 500 600 700 [nm] 生細胞における緑色蛍光タンパクや他の緑色蛍光色素との共染色はでき ない より長い波長での蛍光イメージングへ 5 開発内容の背景 長い蛍光波長の利点 ① 650-900 nmは生体分子による光の吸収が少 ないため、光の組織透過性が高い Nat. Med. 9 123 (2003) White light Blue / Green Green / Red NIR (460-500 nm / 505-560 nm) (525-555 nm / 590-650 nm) (725-775 nm / 790-830 nm) 650-900 nmの光は、生体分子由来の自家蛍光が小さい 400 500 600 Curr. Opin. Chem. Biol., 7, 626 (2003) 700 [nm] 6 開発内容の背景 長い蛍光波長の利点 ② Blue 410-490 nm (nuclei) Green 500-530 nm (microtubules) Yellow 555-565 nm (golgi) Red 580-620 nm (actin fiber) Near-Infrared >660 nm (mitochondria) Science 312, 217 (2006) 一部改 Merge ACS Chem. Biol. 3, 142 (2008) Scale bars, 20 µm マルチカラーイメージングにおける一つのカラー ウィンドウとして有用である 7 発表内容 (1) 赤色カルシウム蛍光プローブ（CaTM-3 AM) (1) 赤色カルシウム 蛍光プローブ Ca2+ (2) 近赤外蛍光消光団（SiNQ780） (3) 企業への期待 (2) 近赤外消光団 五稜化薬(株)より市販化 MMP-9,MT1-MMP recognition sequence Fluorescence Polyethyleneglycols (PEG) for long blood circulation 0.27 Fluorescent dye 近赤外消光団 8 Tumor 0.05 JACS 137 4759 (2015) ACIE 52 3874 (2013) 8 JST先端計測の成果(1) Si置換フルオレセイン Chem. Commun., 47, 4162 (2011) COO O O O フルオレセイン 2-Me TokyoMagenta 494 nm/521 nm ε = 80,000, Φ = 0.85 582 nm/598 nm ε = 110,000, Φ = 0.42 PCT/JP2012/053853 400 500 600 700 [nm] TokyoMagentaはフルオレセインよりも、吸光、蛍光波長が100 nm長波長化した 9 JST先端計測の成果(1) カルシウムイオン濃度変動を検出する蛍光プローブ Berridge, M. J. et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4, 517−529. Ca2+は細胞内の重要なセカンドメッセンジャーとして多くの生命現象に関与し、 10 2+ 細胞質におけるCa 濃度変動は様々な生体応答を惹起する 10 JST先端計測の成果(1) Green sensors Fluo-3 (λfl = 526 nm) 既存のCa2+プローブ Fluo-4 (λfl = 516 nm) Oregon Green 488 BAPTA-1 (λfl = 523 nm) Fura-2 (λfl = 505 nm) Rhod-2 (λfl = 578 nm) Rhod-2は長波長蛍光を 有 する代表 的な Ca2+ プ ローブである Ratio sensor 11 JST先端計測の成果(1) 既存のCa2+赤色プローブ R R R N N O N R O O Localization of Rhod-2 AM in living cells. A549 cells were incubated with Rhod-2 AM (3 µM). Scale bar: 10 µm. N Rhod-2 AM (R = COOAM) AM: acetoxy methyl Rhod-2 AM Mito tracker Merge Localization of Rhod-2 in mitochondria. A549 cells were incubated with Rhod-2 AM (3 µM) and MitoTracker Green FM (0.2 µM), and images were captured. Fluorescence images of Rhod-2, MitoTracker Green FM and merged. Scale bar: 10 µm. Rhod-2 AMは正に帯電し ているため、負に帯電す るミトコンドリアに局在す る特性がある。 12 JST先端計測の成果(1) 光誘起電子移動を利用し、 カルシウムイオンが配位し たときのみ強蛍光性となる カルシウムイオンプローブ を分子設計した 赤色蛍光Ca2+プローブ + Ca2+ Ca2+ Linker e− λabs (nm) = 597 Cl Cl Weakly fluorescent Φfl = 0.024 CaTM-2 Fluorophore λfl (nm) = 609 Kd (µM) = 0.20 Chelator Cl Cl Strongly fluorescent Φfl = 0.39 Egawa, T., et al. Angew. Chem. Int. Ed., 52, 3874 13 JST先端計測の成果(1) 応用例 ①：マルチカラーイメージングへの応用 a) b) c) d) Merged CFP CaTM-2 AM CFP a) CFP (Nucleus) YFP b) YFP (Golgi) CaTM-2 AM c) CaTM-2 YFP d) Merged CFP-nucleus (a, cyan channel) and YFP-golgi (b, yellow channel) transfected HeLa cells were loaded with CaTM-2 AM (c, red channel). Triple-color merged image (d). Scale bar: 10 µm. Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do CaTM-2はCFP、YFPなどの蛍光タンパク質を初め、多くの可視光蛍光を有するタ 14 ンパク質や有機小分子との共染色が可能である 14 JST先端計測の成果(1) 応用例②：CaTM-2の生細胞への応用 R R R N R N O O d CaTM-2 b O NH c 20% ∆F/F0 30 s #7 #6 #5 #4 Si HO Cl #3 O #2 Cl #1 CaTM-2 AM (R = COOAM) R R histamine R N R h Rhod-2 f N O 200% ∆F/F0 g 30 s O #7 #6 #5 N O N Rhod-2 AM (R = COOAM) #4 #3 #2 #1 histamine Visualization of histamine-induced calcium oscillations in HeLa cells utilizing CaTM-2 AM or Rhod-2 AM. (a-d) CaTM-2 AM (3 µM) loaded HeLa cells in HBSS were stimulated with histamine (1 µM). (b,c) Fluorescence images of CaTM-2 at the time points indicated with arrowheads in (d). (d) Fluorescence intensity changes in ROIs of individual cells in (a). (e-h) Rhod-2 AM (3 µM) loaded HeLa cells in HBSS were stimulated with histamine (1 µM). (f,g) Fluorescence images of CaTM-2 at the time points indicated with arrowheads in (h). (h) Fluorescence intensity changes in ROIs of individual cells in (e). Scale bars: 30 µm. 2+ 濃度変動を CaTM-2を用いて、HeLa細胞におけるヒスタミン刺激による細胞質Ca 15 可視化することに成功した 15 JST先端計測の成果(1) 論文化・プレスリリース・市販化 2013年2月19日 Angew. Chem. Int. Ed., 52, 3874-3877 (2013). 2014年11月4日 日経産業新聞2013年3月14日 日刊工業新聞2013年2月21日 2013年5月31日 発売 16 JST先端計測の成果(1) 今回紹介する赤色蛍光カルシウムプローブ pH 3.0 pH 7.0 pH 11.0 計算化学の専門家： 東京大学大学院薬学 系研究科、基礎有機 化学教室 内山真伸 教授との共同研究 2-COOH TM Anal. Chem., 87, 9061-9069 (2015). 17 2-COOH TMはフルオレセインと比較してスピロラクトン環を形成しやすい 17 JST先端計測の成果(1) 従来技術とその問題点 従来の赤色蛍光カルシウムプローブRhod-2は、ミトコ ンドリアに局在し、蛍光波長も578 nmと緑色蛍光と比 較して必ずしも十分に長い波長ではなかった 新技術の特徴・従来技術との比較 • 細胞質に局在し、細胞質のカルシウムイオン濃度変 動を観察できる • 蛍光波長が609 nmであり、緑色蛍光と十分に分離 可能である • 細胞内への導入効率が改良され、高いS/Nでカルシ ウムイオン濃度変動を観察できる 18 発表内容 (1) 赤色カルシウム蛍光プローブ（CaTM-3 (1) 赤色カルシウム AM) 蛍光プローブ Ca2+ (2) 近赤外蛍光消光団（SiNQ780） (3) 企業への期待 (2) 近赤外消光団 五稜化薬(株)より市販化 MMP-9,MT1-MMP recognition sequence Fluorescence Polyethyleneglycols (PEG) for long blood circulation 0.27 Fluorescent dye 近赤外消光団 19 Tumor 0.05 JACS 137 4759 (2015) ACIE 52 3874 (2013) 19 JST先端計測の成果(2) 市販化されている蛍光消光団 Aryl group QSY Dyes Black Hole Quencher (BHQ) Azo group QSY-7 BHQ-2 BHQ-3 QSY-21 QSY-7 QSY-21 ThermoFisher SCIENTIFIC homepage BIO EARCH TECHNOLOGIES homepage 20 JST先端計測の成果(2) 蛍光消光団を用いた蛍光プローブ 蛍光団 蛍光団 消光団 FRET ET = Förster Theory kT = kT kf κ2 J N n R ： ： ： ： ： ： ： 9000(In10)κ2 J kf 128 π5 Enzymatic Activity Non-fluorescent kT /(kT + kf + knr) N n4 Strongly fluorescent ① 距離：R 参考： qPCR用 Molecular Beacon D R6 エネルギー移動速度定数 ドナーの蛍光速度定数 配向定数 重なり積分 アボガドロ定数 溶媒の屈折率 ドナーとアクセプターの距離 消光団 A R ② 重なり積分：J ドナーの 蛍光スペク トル FD(λ) アクセプターの 吸収スペクトル εA(λ) SIGMA-ALDRICH homepageよ ∞ J = ∫ 0 FD(λ)εA(λ) λ4 d λ 21 JST先端計測の成果(2) 従来技術とその問題点 これまでに市販化されている蛍光消光団は、動物個体 での蛍光イメージングに汎用される800 nm付近の蛍光 を十分に消光することができなかった 新技術の特徴・従来技術との比較 • 800 nm付近の蛍光を消 光できる蛍光消光団を 開発した N O3S N 代表的な近赤外蛍光団 SO3Na ICG (Indocyanine green) • Em/Ex = 780/802 nm • Φfl = 0.025 (in PBS) • ε = 200,000 • 肝機能検査薬として使用 22 JST先端計測の成果(2) 基礎とする分子設計技術 10 テトラメチルローダミン 2-Me SiR650 Ex.553 nm/ Em.573 nm Ex.646 nm/ Em.660 nm ACS Chem. Biol., 6, 600 (2011) 650 nm～900 nm 400 500 600 700 [nm] SiローダミンはO-ローダミンよりも、吸光、蛍光波長が約90 nm長波長化した 蛍光団である 23 JST先端計測の成果(2) 近赤外消光団 SiNQ780 SiNQs (Si-rhodamine-based NIR dark quenchers) Absmax = 774nm ΦFL <0.001 Absmax = 647 nm Emmax = 667 nm ΦFL = 0.31 Non-fluorescent J. Am. Chem. Soc., 137 4759 (201 Absmax = 550 nm Emmax = 580 nm ΦFL = 0.85 QSY-21 Absmax = 660nm ΦFL <0.001 Non-fluorescent O原子をSi原子に置換することで、新たな近赤外消光団を開発した 24 JST先端計測の成果(2) 蛍光団 MMP活性検出蛍光プローブ 消光団 FRET 蛍光団 消光団 Enzymatic Activity Non-fluorescent Em. ～730 nm Strongly fluorescent MMP-9,MT1-MMP recognition sequence site Polyethyleneglycols (P for long blood circulati Fluorescent dye SiNQ780 Nat. Rev. Cancer 2, 161 (2002) (modified) Matrix Metalloproteinase ■ MMPはがんや動脈硬化などで過剰発現してい (MMP) る MMPは細胞外基質の切断を行う酵 素 ■ J. Am. Chem. Soc., 137 4759 (2 25 JST先端計測の成果(2) 応用例：動物個体での蛍光イメージング Control probe MMP probe (D-amino acids) White light Fluorescence Fluorescence 0.27 0.08 Fluorescnece intensity at tumor (a.u.) White light 0.2 * * * MMP probe DY MMP Si-QSY DY MMP Si-QSY-D Control probe (control) 0.15 * 0.1 0.05 0 0 1 30 60 120 180 240 Time (min) Time (min) 0.05 0.00 HT-1080 tumor bearing BALB nu/nu mouse Probe; 100 µM in 100 µL PBS 1 % DMSO; Ex: 671 to 705 nm; Em: 760 to 770 nm; Student t test * p<0.05; n = 5. Pictured after 240 min injection. J. Am. Chem. Soc., 137, 4759 ( 担がんモデルマウスでの腫瘍部位でのMMP活性を可視化することに成功した 26 発表内容 (1) 赤色カルシウム蛍光プローブ（CaTM-3 (1) 赤色カルシウム AM) 蛍光プローブ Ca2+ (2) 近赤外蛍光消光団（SiNQ780） (3) 企業への期待 (2) 近赤外消光団 MMP-9,MT1-MMP recognition sequence Fluorescence Polyethyleneglycols (PEG) for long blood circulation 0.27 Fluorescent dye 近赤外消光団 Tumor 0.05 五稜化薬(株)より市販化 JACS 137 4759 (2015) ACIE 52 3874 (2013) 27 企業への期待(まとめ) 想定される用途 (1) 赤色カルシウム蛍光プローブ（CaTM-3 AM) 細胞ベースでの薬剤スクリーニング(GFPなどの緑色蛍光色素と同時に使用できるのが利点 などの緑色蛍光色素と同時に使用できるのが利点) 細胞ベースでの薬剤スクリーニング などの緑色蛍光色素と同時に使用できるのが利点 • • • • 創薬において広く活用されているターゲットであるGタンパク質共役受容体（GPCR）を介した、アゴニ スト刺激による細胞内カルシウムイオン濃度上昇の測定に有用 カルシウムイオンチャネルの活性評価に有用（細胞内カルシウムイオン濃度の測定） セルベースアッセイにおいて多くのデータを獲得できる、蛍光色素を用いて個々の細胞の形態変化、 内部の核酸、タンパク質などの発現、局在変化を解析するハイコンテントアナリシス/スクリーニング （HCA/HCS）に有用 神経細胞における、シナプス活性およびシグナル伝達経路の活性化に伴う細胞内カルシウムイオン 濃度変動の測定に有用 (2) 近赤外蛍光消光団（SiNQ780） • • • • ペプチドをベースとした、酵素活性を検出する近赤外蛍光プローブの開発(動物個体でのイメージン グ用) リアルタイムPCR用の近赤外蛍光プローブの開発 Fmocペプチド固相合成用の近赤外消光団が結合したFmocアミノ酸として 近赤外消光団ラベル用試薬(五稜化薬(株)にMTA中) 上記用途の測定装置のコンパニオン試薬として 28 企業への期待(まとめ) 実用化に向けた課題 • 現段階では何れの試薬も機能的には完成しており、今後は 各々の応用に応じて化学構造の最適化を行っていく 企業への期待 • 測定機器、アッセイ装置のコンパニオン試薬として興味のあ る企業との共同研究を希望 • 近赤外蛍光消光団を用いた新たな蛍光プローブの開発を行 いたい企業との共同研究を希望 • 蛍光試薬のラインナップとして販売したい企業(相談) 上記試薬の合成に関しては、五稜化薬(株)に検討して頂 いており、試薬の安定供給は可能 29 企業への期待(まとめ) 本技術に関する知的財産権 • • • • 発明の名称 ：蛍光プローブ 出願番号 ：PCT/JP2012/053853 出願人 ：東京大学 発明者 ：花岡健二郎、長野哲雄、小出裕一郎、江川尭寛 • • • • 発明の名称 ：近赤外消光団 出願番号 ：PCT/JP2014/082140 出願人 ：東京大学 発明者 ：花岡健二郎、長野哲雄、浦野泰照、明珍琢也 • • • • 発明の名称 ：蛍光プローブ 出願番号 ：PCT/JP2014/055483 出願人 ：東京大学 発明者 ：花岡健二郎、長野哲雄、平林和久 産学連携の経歴 • • • • 2011年-2015年 JST先端計測分析技術・機器開発プログラムに採択 2013年 赤色カルシウム蛍光プローブ 「CaTM-2」の市販化 2013年 近赤外蛍光カルシウムプローブ「CaSiR-1」の市販化 2015年- JST先端計測分析技術・機器開発プログラムに採択 30 お問い合わせ先 東京大学 大学院薬学系研究科 薬品代謝化学教室 花岡 健二郎 ＴＥＬ ０３－５８４１－ ４８５２ ＦＡＸ ０３－５８４１－ ４８５５ e-mail khanaoka＠mol.f.u-tokyo.ac.jp 31
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