［資料］ ［資料］ そば（特定原材料）検査における簡易迅速な そば（特定原材料）検査における簡易迅速な DNADNA 抽出法の検討 抽出法の検討 1＊ 1＊川元 1 1赤松 1 1竹中 2 2 後藤 後藤 操操 川元 達彦 達彦 赤松 成基 成基 竹中 麻希子 麻希子 1 1稲田 1 1 稲田 忠明 忠明 服部 服部 涼子 涼子 A Simple A Simple and and Rapid Rapid DNA DNA Extraction Extraction Method Method forfor Screening Screening Allergic Allergic Substances Substances such such as as Buckwheat Buckwheat 1＊，Tatsuhiko 1＊，Tatsuhiko 1，Shigeki 1，Shigeki 1，1， Misao Misao GOTOU GOTOU KAWAMOTO KAWAMOTO AKAMATSU AKAMATSU 2，Ryoko 2，Ryoko 1 and 1 and 1 1 HATTORI HATTORI Tadaaki Tadaaki INADA INADA Makiko Makiko TAKENAKA TAKENAKA LifeLife Science Science Division， Division， Public Public Health Health Science Science Research Research Center， Center， Hyogo Hyogo Prefectural Prefectural Institute Institute of Public of Public Health Health andand Consumer Consumer Sciences，2-1-29，Arata-cho，Hyogo-ku，Kobe Sciences，2-1-29，Arata-cho，Hyogo-ku，Kobe 652-0032，Japan 652-0032，Japan TheThe applicability applicability of aof Genomic a Genomic DNA DNA Extraction Extraction Kit Kit for Cereal for Cereal Food Food (Extra (Extra method), method), by polymerase by polymerase chain chain reaction reaction (PCR) (PCR) for for rapid rapid DNA DNA extraction, extraction, for for screening screening allergic allergic substances substances (buckwheat) (buckwheat) waswas evaluated. evaluated. TheThe Extra Extra method method waswas used used to to extract extract DNA DNA from from processed processed foodfood models models adjusted adjusted to contain to contain buckwheat buckwheat protein protein at concentrations at concentrations of 1.0, of 1.0, 2.5,2.5, 5.0,5.0, andand 10 10 g/g. g/g. Buckwheat Buckwheat DNA DNA waswas detectable detectable by PCR by PCR in the in the DNA DNA extracted extracted from from the the foodfood models models containing containing ≥2.5≥2.5 g/gg/g of of buckwheat. buckwheat. Moreover, Moreover, the the Extra Extra method method waswas used used to extract to extract DNA DNA from from heat-processed heat-processed foodfood models. models. DNA DNA could could be be extracted extracted from from 3 sample 3 sample types types (boiled, (boiled, baked, baked, andand fried fried foodfood models), models), andand buckwheat buckwheat DNA DNA could could be detected be detected by PCR. by PCR. In In addition, addition, the the monitoring monitoring of commercial of commercial foodfood products products waswas performed performed using using the the Extra Extra method method andand 2 other 2 other DNA DNA extraction extraction methods. methods. ForFor noodles, noodles, baked baked snacks, snacks, arrowroot arrowroot starch starch gruel, gruel, andand bean-starch bean-starch vermicelli, vermicelli, the the results results of DNA of DNA extraction extraction using using the the Extra Extra method method were were identical identical to those to those using using the the other other methods. methods. TheThe Extra Extra method method appeared appeared to be to useful be useful for for extraction/purification extraction/purification of buckwheat of buckwheat DNA DNA from from foodfood products products produced produced with with wheat wheat andand starch. starch. Ⅰ Ⅰはじめに はじめに 施している． 施している． 検査法は， 検査法は， スクリーニング検査としてELISA法による スクリーニング検査としてELISA法による 食物アレルギーは，じんましん，腹痛，呼吸困難など 食物アレルギーは，じんましん，腹痛，呼吸困難など 定量試験を行い，基準値超過の場合など，必要に応じて 定量試験を行い，基準値超過の場合など，必要に応じて 全身に多様な症状を引き起こし，重症化すると意識障害 全身に多様な症状を引き起こし，重症化すると意識障害 PCR法などの定性試験による確認検査を行うこととな PCR法などの定性試験による確認検査を行うこととな 1,2)． 1,2) この ．この っている． などショック症状で生命にかかわることもある などショック症状で生命にかかわることもある っている． このPCR法に用いるDNAの抽出・精製方法に このPCR法に用いるDNAの抽出・精製方法に 6)とイオン交換樹脂タ 6)とイオン交換樹脂タ ような健康被害の発生を防止するため， ような健康被害の発生を防止するため， 2002 2002 年 4年月， 4 月， 厚 厚 は，シリカゲル膜タイプキット法 は，シリカゲル膜タイプキット法 6)が採用されている．両方法は対象食品の 6)が採用されている．両方法は対象食品の イプキット法 生労働省はアレルギー物質を含む食品の表示を義務化し 生労働省はアレルギー物質を含む食品の表示を義務化し イプキット法 3,4)， 3,4) 5,6)， 5,6)，加工度の程度により使い分けられ，多くの種類の食品に 表示が適正かを検証する目的で検査法が通知され ，表示が適正かを検証する目的で検査法が通知され 加工度の程度により使い分けられ，多くの種類の食品に 2004 2004 年度から， 年度から， 兵庫県においてもモニタリング検査を実 兵庫県においてもモニタリング検査を実 対応可能であるが，検査工程に数時間を要する．このた 対応可能であるが，検査工程に数時間を要する．このた め，スクリーニング検査後の確認検査では，健康被害を め，スクリーニング検査後の確認検査では，健康被害を 1 健康科学部 1 健康科学部 2 元2 健康科学部 元 健康科学部 防ぐ観点から，より迅速な判定が望まれる．また近年， 防ぐ観点から，より迅速な判定が望まれる．また近年， ＊別刷請求先 ＊別刷請求先 ：〒652-0032 ：〒652-0032 神戸市兵庫区荒田町 神戸市兵庫区荒田町 2-1-29 2-1-29 DNAを短時間で抽出できる簡便なキットが数多く開発 DNAを短時間で抽出できる簡便なキットが数多く開発 兵庫県立健康生活科学研究所 兵庫県立健康生活科学研究所 健康科学研究センター 健康科学研究センター 7)，適応対象も血液，細菌，動物，植物，土壌等へと 7)，適応対象も血液，細菌，動物，植物，土壌等へと され され 健康科学部 健康科学部 後藤 後藤 操 操 拡充してきている． 拡充してきている． -32--32− 32 − 兵庫県立健康生活科学研究所健康科学研究センター研究報告 第 6 号 2015 2. 試薬 食物アレルギーで，表示義務のあるものは下記の7種 類である．発生件数が多いものは小麦，乳及び卵で，発 2.1 PCR法 生件数は少ないが， 症状が重篤で死亡例もあるものには， 2.1.1 DNA抽出 そば及び落花生がある．最近（2008年6月3日）指定され DNA抽出には，Genomic DNA Extraction Kit for たものにはエビ及びカニがある．そこで今回，そばを対 Cereal Food（FAVORGEN製；以下，Extra法とする） ， 象とすることにした．検査工程を簡便化し，検査時間を 通知法6)で記載のシリカゲル膜タイプキット：QIAGEN 短縮するため，DNAの抽出・精製において，農産物から DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN製；以下，DNeasy法 加工食品まで幅広い加工度に対応した簡易DNA抽出キ とする），イオン交換樹脂タイプキット：Genomic-Tip ットの確認検査への適応性についても検討した．ここで 20/G（QIAGEN製；以下，G-tip法とする）を用いた．ま は，試験試料として，そばの夾雑物が問題となる小麦加 たイソプロピルアルコール（関東化学（株）製） ，エタノ 工品に8)，そばを混和した陽性検体モデル食品を作製し ール（和光純薬工業（株）製） ，Protease K（QIAGEN た．モデル食品を加熱加工したものを試料として用い， 製） ，RNase A（(株)ニッポンジーン製）を使用した． DNAの抽出・精製を検討した結果，有用な情報が得られ 2.1.2 PCR及び電気泳動に用いた標準試薬等 た．また，市販品を対象に通知法記載のDNA抽出法6)と 植物DNA検出用プライマーセット，そば検出用プライ 比較検討したので併せて報告する． マーセット及び陽性コントロールテンプレートは，アレ ルゲンチェッカー「そば」 （オリエンタル酵母工業（株） 製）を用いた．また，PCR反応にはAmpli Taq GOLD & Ⅱ 方 法 10×PCR bufferⅡ/MgCl2 with dNTPs（ライフテクノロ 1. 試料 ジーズジャパン（株）製）及びTE 緩衝液（ （株）ニッポ ①めん類，菓子類（焼き菓子） ，その他の加工品（くず湯 ンジーン製）を使用した．電気泳動では，20bp 分子量マ 粉末，韓国春雨，そば茶）及びモデル食品の原材料は全 ーカー（タカラバイオ（株）製） ，Agarose 3：1 HRB（ア て市販品を用いた． モデル食品作製に使用したそば粉は， ムレスコ製） ，50×TAE緩衝液（ （株）ニッポンジーン製） ， ELISAキット（モリナガFASPEK特定原材料測定キット エチジウムブロミド（和光純薬工業(株)製）を用いた． [ そば （森永生化学研究所製 ] ；以下，FASPEKとする） ） でそばタンパク質濃度を測定し，122.4 mg/gであった． ②そばタンパク質濃度調整モデル食品及び加熱加工モデ ル食品は，以下のように作製した． 3. 測定機器類 粉砕器：GM200（ （株） レッチェ製） ， 遠心器：CF16RX， CF15R（日立工機(株)製） ，分光光度計：UV-2400PC（(株) そばタンパク質濃度調整モデル食品：あらかじめそば 島津製作所製） ，サーマルサイクラー：GeneAmp PCR を含有していないことを確認したそうめんを用いた．ミ System9700（ライフテクノロジーズジャパン（株）製） ， ルサーで粉砕したそうめんの一部に，そば粉を添加し混 電気泳動装置：Mupidα（(株)アドバンス製） ，恒温器： 和した（そばタンパク質濃度；2 mg/g） ．さらにこの均質 IN602W（ヤマト科学(株)製），プレートリーダー： 試料をそうめんで希釈混合し，そばタンパク質濃度が1.0 MultiskanJX（サーモフィッシャーサイエンティフィッ µg/g，2.5 µg/g，5.0 µg/g，10 µg/gのモデル食品を作製し ク(株)製）を用いた． た． ③加熱加工モデル食品：うどんを想定した生めんを作製 4. 測定条件 した．配合は小麦粉，塩，水，さらにそば粉を添加し， 4.1 PCR法及び電気泳動 均質に混和後20 g単位に小分けした．この生めんのそば PCR反応は通知法6)に従い，以下に概略を示した． タンパク質濃度はFASPEKにより51.1 µg/gであった．加 電気泳動は，Agarose 3：1 HRB及びTAE緩衝液で作製 熱加工モデル食品としては，生めんからゆでめん，焼き した４%濃度のアガロースゲルを用いた．PCR反応試料 めん（ゆで＋焼き） ，揚げめん（ゆで＋揚げ） ，オートク 溶液は100 Vで25分間電気泳動を行った．泳動後のゲル レーブめん（ゆで＋オートクレーブ）を作製した．ゆで は0.5 µg/mLのエチジウムブロミドを含んだTAE緩衝液 めんは試料重量の10倍量の沸騰水で7分間ゆでた．さら で35分間染色し，TAE緩衝液で15分間脱色した．UV 312 に，焼きめんはオーブン（180℃）で8分間，揚げめんは nmを照射し，増幅バンドの写真を撮影した．増幅バンド 食用油（170℃）で2分間，オートクレーブめんはオート は，陽性コントロールの植物DNA検出用では124 bp，そ クレーブ（121℃）で4分間あるいは15分間，それぞれ加 ばDNA検出用では127 bpのバンドと比較し確認した． 熱処理し作製した． 4.2 ELISA -33− 33 − FASPEKを用い，既報9)に従い，そばタンパク質濃度を 測定した．加熱加工モデル食品では試料の重量変化を補 正して算出した． Table 1 Concentrations and purity of DNA extracted from processed food models adjusted for buckwheat protein concentrations Ratio DNA concentration (ng/µL) 260 nm /280 nm 260 nm /230 nm に採り，キット付属のFAFG緩衝液600 µLを添加し，ミ AV ± S.D. AV ± S.D. AV ± S.D. キサーで混和した．14,000 rpm，15分間で遠心分離し， 54.3 ± 19.7 1.70 ± 0.10 2.40 ± 0.60 5. DNAの抽出及び精製 Extra法：均一粉砕した試料50 mgを1.5 mLチューブ 上清400 µLを2.0 mLチューブに採取した．イソプロピル アルコール400 µLを混和後，FABGカラムに負荷した． 10,000 rpm，1分間で遠心分離し，溶出液を廃棄後，70% エタノール750µLをカラムに添加した．10,000 rpm，1 分間で遠心分離し，溶出液は廃棄した．TE緩衝液50 µL を添加後1分間静置し，10,000 rpm， 30秒間で遠心分離 してDNA試料溶液を得た． これらの作業工程時間は約25 分間であった． DNeasy法及びG-tip法：通知法6)に従い，DNAを抽出 した． DNA濃度は260 nmの吸光度から算出し，またDNAの 精製度は通知法 6) に従い，260 nm/280 nm及び260 nm/230 nmの吸光度比で確認した． Ⅲ 結果及び考察 n = 10 Table 2 Detection of DNA extracted from processed food models and amplified by PCR Buckwheat protein concentration (µg/g) a) PCR Plant Buckwheat 0.0 ＋ － 1.0 ＋ － 2.5 ＋ ＋ 5.0 ＋ ＋ 10.0 ＋ ＋ a) PCR was performed separately with primer pairs for the detection of plant and buckwheat DNA according to the official Japanese identification test by the Ministry of Welfare, Labour and Health. ＋：positive，－：negative 1. そば含有モデル食品からのそばDNAの検知法 そばタンパク質を含有するそうめんをモデル食品とし て，Extra法10)によって抽出したDNAの濃度及び精製度 をTable1に示した．抽出DNAの濃度は54.3 ng/µL，精製 度は260 nm/280 nm比で1.70，260 nm/230 nm比で2.40 を抽出できることが分かった． 2．加熱加工モデル食品からのDNA抽出の検討 2.1 加熱加工モデル食品からのDNA抽出の検討 食品は加熱により，タンパク質などの変性，分解，重 であった．通知法6)ではPCR反応に適した精製度は260 合及びDNAの断片化などが生じ，DNAの抽出あるいは nm/280 nm比で1.2から2.5の範囲，260 nm/230 nm比で PCRに妨害を及ぼす可能性がある12)．そこで，スクリー 2.0以上とされ，PCR増幅のため抽出DNAを20 ng/µLに ニング検査に用いるそば陽性検体モデルを作製し，さら 調製することとなっており，Extra法10)により抽出され にその検体に加熱加工を施したモデル食品を用いて たDNAは濃度，精製度とも良好であることが確認できた． Extra法10)によるDNAの抽出を試みた．各加熱加工モデ 抽出したDNAのPCR測定結果をTable 2に示した．植 ル食品から抽出されたDNAの濃度及び精製度をTable 3 物DNA検出用プライマー対（通知法6)で，PCR増幅は， に示した． 抽出DNAの濃度は， 26.0 ng/µLから44.5 ng/µL まず，植物DNA検出用プライマー対を用いて行うことと の範囲であり，PCRに適した濃度を得ることができた． なっており，このプライマー対は広く植物DNAを検知す また，精製度は260 nm/280 nm比では加熱加工品が生め ることを目的としている． ）では，全てのそばタンパク質 んに比べ低い傾向であったが，全ての試料が1.2から2.5 濃度の試料でPCRの増幅が認められた．また，そば検出 の範囲で良好であった．280nmの吸光度値はタンパク質 用プライマー対では，2.5 µg/g 以上の濃度でそばのDNA などの不純物由来とされていることから6)，加熱により を検知することが可能であった．通知法6)によるPCRの タンパク質が分解，溶出し，DNA抽出溶液に残存したも 感度は，小麦粉にそば粉を混和した試料による検討で， のと考えられた．260 nm/230 nm比では焼きめん及び揚 10 µg/gは検知でき，1.0 µg/gは検知できなかったと報告 されており11)，ELISA法による定量で表示義務の生じる 10 µg/gを超えた場合，確認試験としてPCR法を実施する ことから，Extra法10)は表示の検証が可能な品質のDNA -34− 34 − げめんが比較的良好な値であったが，全ての加熱加工モ デル食品が2.0を下回った．230 nmの吸光度値は糖など の低分子化合物由来とされ6)，加熱加工によりデンプン などの夾雑物が増加したものと考えられた．特にオート 兵庫県立健康生活科学研究所健康科学研究センター研究報告 Table 3 Concentrations and purity of DNA exrtacted from heat-processed food models of noodles Table 5 Concentrations and purity of DNA extracted from commercial food products by the Extra, DNeasy, and G-Tip methods Ratio Sample DNA concentration (ng/µL) 260 nm /280 nm 260 nm /230 nm Sample Raw noodles 32.0 1.67 1.46 Korean cold noodle A Boiled noodles 31.8 1.46 1.23 Baked noodles 28.8 1.58 1.88 Fried noodles 26.0 1.48 1.70 44.5 1.46 0.73 33.0 1.32 0.75 a) Autoclaved noodle A b) Autoclaved noodle B Korean cold noodle B Cold noodles Wheat noodle A Values are indicated as means，n = 2 Wheat noodle B a) Boiled noodles were autoclaved at 121°C for 4 min. b) Boiled noodles were autoclaved at 121°C for 15 min. Table 4 Detection of buckwheat protein and DNA in heat-processed food models b) a) PCR ELISA Sample (µg/g) Plant Buckwheat Raw noodles 51.1 ＋ ＋ Boiled noodles 50.3 ＋ ＋ 第 6 号 2015 DNA extraction method DNA concentration (ng/µL) Ratio 260 nm /280 nm 260 nm /230 nm 0.81 Extra 19.3 1.36 DNeasy 29.5 1.62 1.24 Extra 31.3 1.40 0.77 DNeasy 24.0 1.57 1.08 Extra 22.0 1.51 2.76 DNeasy 19.3 1.50 0.84 Extra 84.8 1.62 2.20 DNeasy 197.5 1.78 2.15 Extra 73.5 1.61 2.30 DNeasy 365.0 1.81 2.17 Buckwheatcontaining baked snack A Extra 69.5 1.80 1.60 G-tip 133.5 1.84 1.57 Buckwheatcontaining baked snack B Extra 253.0 1.75 1.23 G-tip 202.3 1.84 2.20 Buckwheat tea Extra 43.0 1.16 0.81 G-tip 60.0 0.97 0.33 Arrowroot starch powder Extra 18.0 1.31 2.39 G-tip <5 － － Korean bean-starch vermicelli Extra 8.5 1.18 4.88 G-tip <5 － － a) Baked noodles 49.9 ＋ ＋ Values are indicated as means，n = 2 Fried noodles 21.7 ＋ ＋ a) The ratio could not be calculated because the absorbance was 0. c) 44.4 ＋ ＋ d) 34.4 ＋ － Autoclaved noodle A Autoclaved noodle B DNAを検知できなかった．Table 3で示したように，260 a) ELISA was performed using a Morinaga FASPEK allergic substance measurement kit (buckwheat). nm/230 nm比は明らかに低値であり，オートクレーブめ んA（４分間加熱）と比べ，DNA濃度は低下した．この b) PCR was performed separately with primer pairs for the detection of plant and buckwheat DNA according to the official Japanese identification test by the Ministry of Welfare, Labour and Health. ＋：positive，－：negative 原因として，長時間のオートクレーブ処理でDNAの低分 子化13,14)が進んだこと，及び低分子化したタンパク質な どがPCRを妨害した可能性が考えられた． c) Boiled noodles were autoclaved at 121°C for 4 min. d) Boiled noodles were autoclaved at 121°C for 15 min. 2.2 市販食品からのDNA抽出の検討 クレーブめんでは明らかに低値となり，加圧も加わった めん類，そばを含む焼き菓子，デンプン含有量の多い ため，より多くの夾雑物がDNA抽出溶液に溶出したもの 春雨など10種類の市販食品を対象に，Extra法10)の適用 と推察された． 性についてDNeasy法6)及びG-tip法6)と比較検討した． 通知法6)において，加工度の低い食品に対応している 各加熱加工モデル食品のELISAによるそばタンパク 質濃度及び抽出DNAのPCR測定結果をTable 4に示した． DNeasy法6)はめん類5品，加工度の高い食品に対応して そばタンパク質濃度は加熱加工により減少したが，全て いるG-tip法6)は焼き菓子など5品からそれぞれDNAの抽 のモデル食品は陽性の範囲であった．植物DNA検出用プ 出・精製を行った．抽出したDNAの濃度及び精製度は ライマー対による抽出DNAのPCRでは， 全てのモデル食 Table 5に示した． 品でPCR増幅を確認できた．また，そば検出用プライマ 加工度の低い食品から両方法で抽出したDNAの濃度 ー対では試行した４種類の加熱方法で加工した試料にお は，韓国冷めんA及び冷めんにおいて20 ng/µL前後の濃 いてそばDNAを検知できた．しかし，オートクレーブで 度となった試料が認められたが，その他の食品からは良 15分間加熱したオートクレーブめんBは，揚げめんと比 好な濃度が得られた．精製度は260 nm/280 nm比では 較して高濃度にそばタンパク質を含有していたが，そば Extra法10)が1.36から1.62，DNeasy法6)が1.50から1.81 -35− 35 − の範囲でDNeasy法6)の精製度が高い傾向であったが，い ずれも良好な範囲であった．また260 nm/230 nm比にお いては，うどんでは両方法とも良好で，韓国冷めんでは Table 6 Detection of DNA that was extracted from commercial food products by the Extra, DNeasy, and G-Tipmethods and amplified by PCR 両方法ともに低値を示した．冷めんについては片栗粉が Sample 原料として使用されており，DNeasy法6)における精製度 Korean cold noodle A の低下の一因と考えられた． 加工度の高い食品において，そば焼き菓子及びそば茶 では両方法とも抽出DNAの濃度は良好であった．そば焼 き菓子の精製度は，そば焼き菓子Bにおける260 nm/230 nm比でExtra法10)に比べG-tip法6)が高値であったが，そ の他の精製度の指標は同程度であった．また，そば茶の 精製度は，いずれも低値で夾雑物が多いと考えられた． くず湯粉末及び韓国春雨では両方法とも得られたDNA 濃度は低値で，特にG-tip法6)では痕跡程度しかDNAを採 取できなかった．Extra法10)の精製度は260 nm/280 nm 比では適合ライン付近であったが，260 nm/230 nm比は 良好であった．ここで用いたくず湯粉末は芋類のデンプ ンを含む製品であり，春雨は主に緑豆あるいは芋類のデ ンプンで作られている．従って，Extra法10)はデンプンの 豊富な食品からのDNA抽出に適応可能と考えられた．な お，G-tip法6)では測定した吸光度が0または0付近であっ たため，精製度を算出できなかった． ELISAによるそばタンパク質濃度及び各抽出法で得 Korean cold noodle B Cold noodles Wheat noodle A Wheat noodle B Buckwheat-containing baked snack A Buckwheat-containing baked snack B Buckwheat tea Arrowroot starch powder Korean bean-starch vermicelli ELISA a) (µg/g) > 20 > 20 <1 <1 12.4 > 20 > 20 > 20 20.0 <1 b) DNA extraction method Plant Buckwheat Extra ＋ ＋ DNeasy ＋ ＋ Extra ＋ ＋ DNeasy ＋ ＋ Extra ＋ － DNeasy ＋ － Extra ＋ － DNeasy ＋ － Extra ＋ ＋ DNeasy ＋ ＋ Extra ＋ ＋ PCR G-tip ＋ ＋ Extra ＋ ＋ G-tip ＋ ＋ Extra ＋ － G-tip ＋ ＋ Extra ＋ ＋ G-tip ＋ ＋ Extra ＋ － G-tip ＋ － a) ELISA was performed using a Morinaga FASPEK allergic substance measurement kit (buckwheat). b) PCR was performed separately with primer pairs for the detection of plant and buckwheat DNA according to the official Japanese identification test by the Ministry of Welfare, Labour and Health. ＋：positive，－：negative たDNAのPCR測定結果をTable 6に示した．10種類の食 工された菓子類及び主原料がデンプンの加工食品におい 品のそばタンパク質濃度は，冷めん，うどんA及び韓国春 てPCRに適用可能なDNAを抽出・精製することができた． 雨を除く7種類が陽性検体であり，このうちうどんB及び この方法は，対象となる食品によっては，より迅速にス くず湯粉末は微量混入であった．植物DNA検出用プライ クリーニング検査の確認が可能と考えられ，健康被害の マー対を用いたPCR法では， いずれの抽出法で得たDNA 予防に貢献できるものと考えられた．今後は，その他の においても全ての食品についてPCRの増幅が認められ 加工食品に対しても適用範囲の拡大のため検討を続ける た． そば検出用プライマー対では９種類の食品において， 必要があると考えられた． いずれの抽出法で得たDNAのPCRもELISAの結果と一 致した．しかし，そば茶ではExtra法10)により抽出した Ⅳ 結 論 DNAでそばを検知できなかった．そば茶は，一度蒸した 特定原材料（そば）の検査において，PCR法に用いる 後に焙煎されることから，焼き菓子と比較し加工度が高 DNAを短時間で抽出が可能なGenomic DNA いと考えられる12)．加熱加工モデル食品における検討で， Extraction Kit Cereal Food（Extra法）の適用を検討し 長時間のオートクレーブ加工を施した食品ではそばを検 た．そばタンパク質濃度を1.0，2.5，5.0，10 µg/gに調整 知できなかったことから，そば茶は蒸し工程に加え，長 したモデル食品からExtra法により抽出したDNAを用 時間の加熱工程で食品由来成分の分解あるいは反応など いたPCRで，2.5 µg/g以上（陽性判断ライン：10 µg/g） が進み，PCR反応が阻害された可能性が考えられた． のそばを検知可能であった．また，めん類で加熱加工を また，G-tip法6)はα-アミラーゼを用いており，デンプ 施したモデル食品においてExtra法によるDNAの抽出 ンの多い食品に対応可能となっている．一方，Extra法10) を行った結果，ゆでめん，焼きめん，揚げめんからDNA は酵素を用いていないが，くず湯粉末，韓国春雨，冷め を抽出可能であることを確認でき，PCR法によりそば んといったデンプンを比較的多く溶出すると考えられる DNAを検知できた．さらに，Extra法と通知法で採用さ 食品からDNAを抽出することができた． れているDNeasy Plant Mini Kit及びGenomic-Tip 20/G 以上の結果から，室温条件で30分以内にDNAの抽出・ を用い，市販品を対象にモニタリング検査を行った．そ 精製が可能なExtra法10)は，加工度の低いめん類，加熱加 の結果，Extra法で抽出したDNAは，めん類，焼き菓子， -36− 36 − 兵庫県立健康生活科学研究所健康科学研究センター研究報告 第 6 号 2015 くず湯，春雨で通知法と同じ結果を得ることができた． suitable for processed foods. Jpn. J. Food Chem. Extra法は特定原材料（そば）の検査で小麦及びデンプン Safety, 20, 96-104（2013） を原材料とする食品を対象とする確認検査において， 8) DNA抽出・精製法として有用であると考えられた． 小泉充正，高橋智樹，松木諭和，濟田清隆，池野恵 美，櫻井有里子，渡部健二朗：食品製造施設におけ るアレルギー物質のコンタミネーションに関する 文 献 一考察．食品衛生研究，57，67-71（2007） 9) 1) 2) 海老澤元宏：食物アレルギー関連の最近のガイドラ 能性のある加工食品原料についての前処理法の検 インの進歩（食物アレルギー患者への対応） ．アレル 討－凍結乾燥の適用性－．兵庫県立健康生活科学研 ギー，60，551-558（2011） 究所健康科学研究センター研究報告，4，31-34 小俣戸貴嗣，宿谷明紀，海老澤元宏：アレルギー診 （2013） 断と対応（食物アレルギー―乳幼児期） ．小児科診 10) 後藤操ら：第４８回全国衛生化学技術協議会年会講 演集，p90-91，長野 (2011) 療，77，1297-1303（2014） 3) 4) 厚生労働省医薬局食品保健部長通知：食品衛生法施 11) Yamakawa, H., Akiyama, H., Endo, Y., Miyatake, 行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省 K., Sakai, S., Kondo, K., Toyoda, M., Urisu, A., 令の一部を改正する省令等の施行について．平成13 Teshima, R. ： Specific Detection of Buckwheat 年3月15日，食発第79号 (2001) Residues in Processed Foods by Polymerase 消費者庁次長通知：アレルギー物質を含む食品に関 Chain Reaction. Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, する表示について．平成25年9月20日，消食表第257 2228-2231（2008） 号 (2013) 5) 12) 大坪研一，中村澄子，原口和朋：PCR法による醸造 酒の原料判別技術．新大農研報，61, 1-9（2008） 厚生労働省医薬局食品保健部長通知：アレルギー物 質を含む食品の検査方法について．平成14年11月6 6) 13) 高橋邦彦，石井里枝，松本隆二，堀江正一：加工モ 日，食安発第1106001号 (2002) デル実験によるコメ内在性DNAが検出されなかっ 消費者庁次長通知： 「アレルギー物質を含む食品の たビーフンに関する一考察．食衛誌，51, 37-42 検査方法について」の一部改正について．平成26年 3月26日，消食表第236号 (2014) 7) 後藤操，藤田昌民，三橋隆夫：アレルギー発症の可 （2010） 14) 橋本博之，眞壁祐樹，長谷川康行，佐二木順子，宮 Minegishi, Y., Mano, J., Kato, Y., Kitta, K., 本文夫：ネステッドPCR法を用いた食品中の特定原 Akiyama, H., Teshima, R., ：Development and 材料（小麦）の検出．食衛誌，49, 23-30（2008） evaluation of a novel DNA extraction method [平成27年5月14日受理] -37− 37 −
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