免疫染色 原理 - 株式会社アマネセル

【特集】
コミュニケーションはそのほとんどが“非”言語で成り立っていることをご存知でしたか?
アメリカの心理学者アルバート・メラビアン氏によると、話者が聴者に与えるインパクトのうち、
・文字情報(言葉自体の意味、話の内容など)=7%
・声(声の高低、大小、強弱、スピード、イントネーションなど)=38%
・視覚情報(表情、動作、立ち振る舞いなど)=55%
であると述べています。
さらに、人間の感覚器官のうち視覚を通じて得る情報量は全体の 87%にものぼると言われています。電話など
アマネセルでは、本社(北海道)と営業所(東京・新横浜・大阪)が離れており、社員全員と直接顔を見て話す機会というものは年に
1∼2 回ほどしかありませんでした。
そこで、本社と営業所間のコミュニケーションをもっと活性化させたい!直接顔を見ながら話したい!という想いから、今回テレビ会
議システムを導入することとなり、より密接したコミュニケーションの実現に成功しました。
アマネセルでの活用法
①全体朝礼にて
月 1 回、本社で行われる全体朝礼に営業所か
らも参加可能となりました。社長挨拶をはじめ、
前月の検査数報告や社内全般の連絡事項を全
社員の顔を見ながら伝達できます。顔を見る機
会が少ない本社と営業所間のコミュニケーション
に非常に役立っています。
の聴覚情報だけでは、言葉の順序を入れ替えたりすると意味が通じない場合も出てきてしまいますが、そこに視
覚情報を付け加えることによって、より正確で円滑なコミュニケーションを取ることができます。
本社
③症例検討会、研修にて
Polycom Group 500
移動も簡単!!
・最大 6 拠点まで接続可能
・グループでのテレビ会議に
最適
キャスター付きのテレ
ビ会議専用スタンドな
ので、場所を選ばずに
効 率よ く会 議 がで きま
す。国内市販のほとん
どのディスプレイに対応
しています。
Polycom Group 500
PC の画像も共有可能!!
Excel や PowerPoint をはじめ、CT
やレントゲンなどの画像、電子カル
テも同時にテレビ画面へ映しだし、
それを見ながら会議をすることが
できます。
新横浜出張所
②社内プロジェクト報告にて
社内で取り組んでいるプロジェクトの報告にも使
用しており、営業所員からの報告が容易になりまし
た。本社までの飛行機代・宿泊代の節減だけでは
なく、移動による業務への支障を最小限に抑え、仕
事の効率化にもつながっています。
お得な定額制!!
専用 VPN 回線
東京営業所
定額回線なので、いくら使っても
定額料金以上は請求されません。
テレビ会議は会議をすればするほ
どお得になります。
大阪営業所
毎週行われている症例検討会や社内研修にも使
用しています。
従来の症例検討会では、本社の職員しか参加す
ることができなかったのですが、現在では営業所
からもリアルタイムで参加することができるようにな
りました。今後営業を行う上で、身につけておきた
い症例に関する知識を、診断医と直接討論するこ
とができるので、より理解が深まります。
今後は、社内研修の頻度も増やしていくので、こ
れまで以上に活発な情報交換が期待できます。
【特集】新たなコミュニケーションツールの模索∼テレビ会議システムを導入して∼
人の医療現場では
様々な使用事例
①優れた映像品質で、
患者へのきめ細かいケアが可能に
②手術などの技術を伝え、
遠隔地の医療従事者を教育
遠隔地にいるエキスパートとその場での意見交換を実現させ、迅速に
中核病院と遠隔地にある診療所を接続することで、手術室に入れない他
セカンドオピニオンを得ることができます。その際、レントゲン写真や MRI
の医療従事者や医学者への精度の高い指導を実現します。また、大学病
などカメラや PC 上の高解像度画像の共有もできます。
院で開催されるカンファレンスにも、自分の診療所から診察の合間などに参
加できるようになるので、医師同士の情報交換をサポートします。
動物病院での
活用方法
③手術室や入院室に
②夜勤や往診先、
在宅患者とのやり取りに
①日々の重要な伝達事項に
入院している患者さんの容態がどこにいても確認できます。混雑時
や夜勤などの少人数体制でも患者さんの急変に迅速に対応でき、安
心して診療業務に取り掛かることができます。
遠隔地にいる医師あるいは専門医に助言を求めたいときなど、リア
また手術室にも取り付けることで、飼い主さんの希望があれば手術
院内のミーティングや朝礼へ場所を選ば
ルタイムでなおかつ画像からの視覚情報も取り入れながら意見交換
中待機している部屋でもその様子を確認することができます。術中
・出欠確認
ずに参加することができ、重要な連絡事項も
をすることができ、より確実な診断・処置を行うことができます。テレビ
の音声は ON/OFF ボタン1つで切り替え可能となっており、飼い主
・引き継ぎ事項
リアルタイムで伝達できます。院長先生や外
会議は高画質・高音質なので、患者さんの容態や傷の状態なども鮮
さんに確認したいことが出てきた場合には、手術中でも
・診察内容報告
出中の医師との意見交換を容易にするの
明に確認することができます。
すぐに会話をすることが可能です。
・本院、分院の連絡事項
・入院動物の状態や
診療内容
etc.
で、業務の効率化が期待できます。
また、在宅でケアをする場合でも、定期的に接続することで治療に
そして、なんといってもテレビ会議システ
関する上でのアドバイスが可能となります。
ムでは、直接職員同士が顔を見ながらコミュ
④院内研修や勉強会に
ニケーションを取ることができます。患者さんの容態やその場の状況を直
接目で見て確認できる、また飼い主さんも交えながら意見交換をすること
院内研修や勉強会にて、電子カルテやレントゲン写真などを映しな
夜勤の時に…
ができるので、より確実で伝達ミスの少ない診療が可能となります。
がら討論することができるので、技術の向上や知識の統一化が大い
に期待できます。
また、内容を録画することもできるので、出席できなかった職員や新
しく入ってきた新入職員の教育にも活かせるでしょう。
本院
分院
院長自宅
在宅患者
本院
往診先で…
やり取りに…
録画 OK!
※テレビ会議システムに関するお問い合わせ・ご相談は裏表紙にてご確認ください。
分院
(学術広報部 樋口英里子)
テクニカルビュー
登場
免疫染色;略
既刊 当誌記事
免染
免染
病理診断(特 腫瘍診断) 欠
診断 利用
視点 登場
が、今回ここでは、免染をテクニカルな目線で紹介します。
免疫染色 原理
マスキング剥がし
免染は、検査標本上の細胞・組織に存在するタンパク質(=抗原)
を特異的に結合する試薬(=抗体)で検出する、いわゆる“抗原抗体
反応”を原理とする染色法です。この抗原抗体反応を酵素反応を利用
して可視化する免染は、「酵素抗体法」と呼ばれ、これが病理検査に
おける免染の標準法です(図1)。原理的には、一次抗体さえ入手でき
れば、あらゆる抗原を染め出すことが可能です。しかし、一次抗体の
ほとんどはヒト抗原の決定基に最適な抗体として市販されています。
発色
図1
基質液
酵素標識
二次抗体
では、どのようにマスキングを剥がして免染をしているのかを説明すると…実は、マスキング剥がし(抗原賦
活操作)は下記のような試薬や意外な家庭用機器を使用して行われています。
マスキングの本体は、主として固定処理等で生じる抗原決定基での架橋形成や各種結合の崩壊によると
言われています。これらのマスキングは、蛋白分解処理や高温処理(温浴や煮沸)によって改善することがで
きます(下記写真)。さらに、高温処理の場合には、標本を浸漬する緩衝液の種類(酸性 or アルカリ性)によっ
ても効果が異なってきます。
(例)B リンパ球を鑑別する CD20 抗体の場合
一次抗体の正式名: 『抗ヒト CD20 ウサギ免疫グロブリン』
→ヒト CD20 をウサギに免疫して作製したウサギ抗体
当社ではこの CD20 抗体がイヌ、ネコ、フェレットの CD20 と結合す
ることを確認し検査に使用していますが、トリでは結合がみられませ
ん。このように、同じ名前の抗原でも動物種が異なると使用できないこ
とがあります。もうひとつ、抗体に起因して検査に不都合なことがあり
ます。上記例で説明すると、CD20 の一次抗体はウサギの免疫グロブ
リンなので、二次抗体はウサギ免疫グロブリンに結合(図1:○部分)
するものを使用します。この場合、ウサギの検査に使用すると一次抗
体だけではなく、組織に存在する免疫グロブリンにも結合するため抗
原部位だけを特異的に染め出せず検査不能となります。
このように動物検査で免染をする場合には試薬の制約を受けること
が多くありますが、実は病理検査標本での免染では、ヒト・動物にかか
わらず、標本作製に起因する大きな問題があります。
一次抗体
蛋白分解酵素
検査組織
賦活法の歴史.
当初は蛋白分解酵素が主流でしたが、1990 年代より電子レンジによ
る賦活法が普及し始め、作用機序の議論も活発におこなわれてきまし
た。マイクロ波の直接効果?とも推測されてきましたが、その後、他の
高温処理(温浴や煮沸)でも賦活効果が高いことが明らかになり、現在
では加温効果によるマスキングの解除機構と考えられています。
抗体 抗原 認識
部位 「抗原決定基」
です(
)。10 個程度
酸残基
構成されています。
賦活の効果
図2
Chromogranin A*(イヌ、副腎)
一次抗体
抗 原
ホルマリン固定などの影響で、抗
原 立体構造 乱
生
スキング』されるため、抗体の結合
が難しくなります。
処理
凍結標本とは….
氷点下で固化する包埋剤に検体を浸して急速冷凍し、特殊な薄切装
置(クリオスタット)を用いて氷点下で薄切し作製する標本です。固定や
包埋による影響が少なく、より生体内に近い条件の標本として扱える利
点があります。また、検体採取後数十分で標本作製できるので、ヒト検
査では術中迅速病理診断でも利用されています。
圧力鍋
抗 原
標本上の抗原の状態
ところで、病理診断に最適な検査標本とは、細胞・組
織形態がしっかり保持されているものです。つまり、固
定・脱水・パラフィン浸透などの処理がしっかりと施され
た標本になります。しかし、実は標本を作製するこれらの
処理こそが、免染を難しくさせている一つの要因でもあり
ます(図2)。実際に、固定やパラフィン包埋をしてしまうと
全く染めることの出来ない抗原も多く存在します。それら
抗原を検出するためには、より生体時に近い状態の標
本(凍結標本など)が必要になることもあります。
電気ポット
電子レンジ
*
(
状態)
神経内分泌顆粒中 存在
沸騰処理
(圧力鍋 TE 緩衝液 pH8)
一例をあげると、副腎髄質細胞に存在
する Chromogranin A は、マスキングによ
って抗体結合性が低下していますが、圧
力鍋での賦活操作によって明瞭に染色さ
れるようになります(左写真)。
このように、賦活法の導入進歩によっ
て、以前はパラフィン標本で染め出せな
かった抗原が検査に利用できるようにな
りました。免染手技の改良は病理診断精
度の向上に大きく寄与しています。
糖蛋白
当社では、新抗体の導入時は、抗原賦活の要不要、最適な賦活法の検討などを行い、検査用の染色プロ
トコールを作成しています。今後も検査用抗体のラインアップを充実させ、より説得力のある病理診断を提供
していきたいと考えています。
(病理技術部 會田浄)
Technical view
Technical view
免疫染色の奥義
当誌
石川県河北郡内灘町
たむら動物病院
【院長】
田村 兼人
076-286-0331
【診療時間】
・月曜∼土曜
9:00∼12:00
14:00∼19:00
(※木曜のみ午後
は 16:00∼)
・日曜・祝日
9:00∼12:00
14:00∼17:00
【従業員数】
17 名
(受付担当:4 名)
お聞きした人
エビデンスに基づく診断
アマネセルの
取引先病院様を
ご紹介させていた
だきます!今回は、たむら動物病院で
勤められている相原様にお話を伺こと
ができました。
悪性黒色腫
動 物 病 院 の 受 付 で 実 際 に働 い てみ
て、どのような印象をお持ちですか。
ただ動物が好きだという気持ちだけではできな
い仕事だと強く感じます。ここは病院なので、病
気の重い子や亡くなってしまう子もいる中で、初
めはショックがとても大きかったです。入った当
初は、ご飯も食べられなくなるほど落ち込むこと
もありました。楽しいだけではなく、命の重みを強
く感じる場面が多いことに気付かされました。
受付業務を行っていて、苦労したこと
はありますか。
以前の勤務先では、あまりニコッと笑うような
接客ではなく、どちらかというとキリッと締まった
対応を長年してきたので、最初の頃は「きつい、
怖い」という印象を持たれてしまうことが多くあり
ました。特にこの病
院はアットホームな
感じの病院を目指
しているので、その
雰囲気に慣れるま
でには時間がかか
りましたね。
相原 純子さん
たむら動物病院に勤
められて 10 年目。以
前は、車販売店の受
付業務を行っており、
受付業務のスペシャ
リスト。動物看護師の
資格も持っているが、
今は受付専門として
▲相原様
活躍中。
秀俊
口腔内腫瘤ナンバー1
動物病院で働こうと思ったきっかけを
教えて下さい。
以前、車販売店の受付業務を行っていました
が、結婚を機に内灘町へ来ました。新たな仕事
を探す上で、これまでの受付業務のスキルを活
かせるような仕事をしたいと思っていた頃、当院
の求人を発見しました。私自身、動物が大好き
なこともあり、それで応募したのがきっかけです。
職種は違いますが、受付業務に通ずるものは似
ていて、今までの経験や知識が糧となって現職
に活かされていることは間違いありません。
高橋
“うちの院長のここが好き!”というポ
イントを教えてください。
学校飼育動物の教育など病院の診療以外の
業務でも多忙な中、患者さん一人ひとりに丁寧
に接している所をすごく尊敬しています。院内が
混んでいるから早くしなきゃということはなく、ど
んなに小さなことでも時間をかけて丁寧に向き合
うので、患者さんからも「先生の顔を見ただけで、
治ったような気がする」とおっしゃっていただくこと
が多いです。
たむら動物病院のアピールポイントを教
えてください。
北陸には動物の大学病院がないので、そういっ
た環境下でも確実な診断と診療ができるよう、職員
の知識向上はもちろん、設備等も充実させ、高水準
の医療体制を常に整
えています。CT も
完備し、来年には新
たな手術室とリハビ
リ室も完成する予定
CT 室
です。地域密着型の
病院なので、常に飼い主さんの気持ちに寄り添った
対応を徹底しています。少しでも不安を和らげられ
るような存在でありたいですね。
悪性黒色腫は、イヌの口腔内腫瘍の中で最も発生の多い腫瘍です。弊社の統計(Amanecer Annual 2013)では、口腔
組織検査例の 23%を占めています。雄での発生がやや多く見られますが、年齢平均は雌雄ともに約 12 歳です。
口腔内で隆起性病変を形成
歯肉部を始めとして口腔内の様々な部位に、大きく隆起する病変を形成しますので、炎症性の増殖性病変であるエプー
リスなどとの鑑別が必要となります。
メラノサイトは元来、扁平上皮細胞間に介在するようにも存在していることから、口腔内に発生した悪性黒色腫も扁平上
皮間を拡がる能力を有しています。これを接合部活性と呼び、粘膜を構成する扁平上皮層内で腫瘍細胞が増生すること
により、粘膜層が破壊され、腫瘍表層はびらんを呈していきます。進行した病変では表層に炎症巣が形成されることも多
く、表層部のみからの採取での検査では診断がつかない場合もあります。
一部組織で確認する(写真 1,2)
塗抹標本で確認する(写真 3,4)
悪性黒色腫は様々な増殖形態や細胞形態を取りますが、
上皮様の場合には扁平上皮癌、肉腫樣の場合には線維肉
腫や悪性リンパ腫との類症鑑別が必要となります。採取部
位によってその形態が多彩に変化し、また、悪性黒色腫は
色素細胞(メラノサイト)由来の悪性腫瘍ですが、腫瘍細胞
のメラニン産生能は様々で、肉眼上の色調もまちまちです。
腫瘤内部から取れてくる細胞は、細胞質が広くて核が円
形である類上皮細胞ですが、細胞膜がはっきりせず、細胞
の境界がよくわかりません。ギムザ染色で細胞質に黒褐色
の色素が見えていますが、扁平上皮細胞にもメラニン沈着
する場合もありますので、注意が必要です。
写真 3
写真 1
【組織検査例(強拡大、HE 染色)、メラニン色素が多い症例】
細胞質に見られる黄褐色のメラニン色素の量はあってもまちまち
【塗抹標本(ギムザ染色)、メラニン色素が多い症例】
細胞境界は不明瞭で、細胞質にメラニン色素顆粒が見られ
る。細胞質に見られる黄褐色のメラニン色素の量は、隣り合
わせの細胞であってもまちまち
▲待合室
▼ドッグラン
診察状況が把握できる電光掲示
板。診察室の状況や待っている
人数がすぐに分かるので、飼い
主さんにも大好評です。
受付カウンター
相原様、たむら動物病院の皆様、ありがとうございました。 (インタビュー:学術広報部 樋口英里子)
写真 2
【組織検査例(強拡大、HE 染色)、メラニン色素が少ない症例】
類上皮様細胞ですが、細胞質に見られる黄褐色のメラニン色
素の量は、隣り合わせの細胞であってもまちまち
写真 4
【塗抹標本(ギムザ染色)、メラニン色素が少ない症例】
類上皮様細胞で、細胞質は広いのですが、黄褐色のメラニン
色素の量はわずか
症 例
紹 介
組 織球とは?
犬の組織球増殖性疾患
②皮膚反応性組織球症(Fig.2)
骨髄幹細胞
血液
皮膚組織球腫に類似した疾患ですが、由来する細胞は間
質樹状細胞と考えられています。頭頸部や腋窩、会陰に好
発し、3 歳以上の発生が多いとされています。好発犬種はあ
りません。主にドーム状に盛り上がる病変を形成する皮膚組
織球腫と異なり、真皮から皮下へ拡がる多発性結節を形成
し、稀に自然退縮することもあります。なお、治療法として、シ
クロスポリンやレフルレミドなどの免疫抑制剤の投与が効果
的であり、腫瘍というより、免疫調節異常疾患と考えられてい
ます。
・浸潤する細胞は組織球、
リンパ球が主体、肉芽腫
様を呈す
・血管周囲性に増殖、血管
壁への浸潤もみられる
・核分裂像は少ない
・表皮内への浸潤はみられ
ない
単球
組織
滲出マクロファージ
炎症に反応して遊走
・マクロファージ
異物巨細胞
在住マクロファージ
=組織球
組織に定着
・クッパー細胞(肝臓)
・ランゲルハンス細胞(表皮)
・間質樹状細胞(真皮)など
犬 の組織球増殖性疾患
組織球増殖性疾患は、MPS 細胞のマクロファージと樹状
細胞に由来する反応性、あるいは腫瘍性増殖疾患として定
義され、犬では以下の 4 種類が分類されています。
①皮膚組織球腫(Fig.1)
主に 2 歳齢以下の犬に好発する良性の皮膚腫瘍で、由来
となる細胞は、表皮内に存在する樹状細胞(ランゲルハンス
細胞)とされています。好発部位は、頭頸部や四肢などで、ほ
とんどが単発性です。また、未処置でも数週間∼数か月で自
然退縮しますが、中∼高齢犬に発生したものは退縮しにくい
傾向にあります。
Fig.1
塗抹標本からでもリンパ球免疫染色ができると
聞いたのですが。
<7 月症例検討会より>
白血球系細胞の一群である単核食細胞系(MPS)細胞(外
来異物の貪食、および抗原提示能力を有して免疫機能に関
与する)の一種です。
骨髄
その疑問!お答えします!(2)
・くびれをもつ腎臓型
(kidney shape)の核(黄
矢印)と淡明∼弱好酸性
の広い細胞質を持つ
・細胞境界はやや不明
瞭、多数の核分裂像
・表皮内への浸潤を示す
ことがある(表皮向性リ
ンパ腫でも見られる)
・リンパ球(緑矢印)の浸
潤、壊死巣の形成を伴う
Fig.2
③全身性反応性組織球症(Fig.2 と同様)
皮膚反応性組織球症と同様に、間質樹状細胞に由来する
疾患です。皮膚(特に四肢)や鼻腔、リンパ節、脾臓、肺な
ど、全身の様々な臓器に発生します。成犬に発生し易く(2∼
8 歳)、バーニーズマウンテンドッグを始めとする大型犬に好
発します。自然退縮することもありますが、皮膚反応性組織
球症よりもさらに稀です。また、治療法としては、皮膚反応性
組織球症と同様に免疫抑制剤が用いられます。なお、重症
例では効果は薄く、組織球肉腫と同様な化学療法が必要と
なり、予後はあまり期待できません。
④組織球性肉腫(Fig.3)
組織球に由来する悪性腫瘍で、臨床的に局所性と全身性
(播種性)に分類されます。樹状細胞に由来するとされていま
すが、稀に見られる血球貪食性の組織球肉腫はマクロファー
ジに由来すると考えられています。局所性のものは四肢・関
節周囲に好発し、全身性のものは脾臓を主体として、皮膚や
リンパ節、肺、肝臓など様々な臓器に発生し、好発犬種は全
身性反応性組織球症に類似しています。治療法としては外
科的切除と化学療法が選択され、局所性のものは寛解する
こともありますが、全身性の予後は不良です。
・異型の強い組織球様細胞
が増殖、多数の核分裂像
(黄矢印)
・多核巨細胞(緑矢印)が
散見される
Fig.3
(病理診断部 駒形真)
アマネセルに関する様々なご質問
について、お答えするコーナーです。
今回はリンパ球免疫染色に関する
ご質問にお答えします!
はい、イヌ・ネコのみ受付しておりまして、弊社で販売
しております、細胞診免疫染色用「塗抹標本作製器材
セット※」(作製標本数 25 枚用/税別 1,600 円)を使用し
て作製した標本で検査可能です。
お便り紹介コーナー
「塗抹標本作製器材セット」を使用していない塗抹標
本での検査は難しいですか。
◆基本的な事から、解りやすく説明さ
れ て い て 良 かっ たで す。 特 に 、犬 の
MCT における新しいグレード分類法が
印象に残っています。今後は、細胞診
を実施時の注目点、ポイントなどを教
えてほしいです。
大阪府・内田様
免疫染色は染色工程が長く、細胞が標本より剥離す
る可能性が高まりますので、弊社で検証済の剥離防
止機能付の高性能スライドガラスと専用の固定液を
使用して作製した標本のみ検査可能です。
ご意見ありがとうございます。犬の
MCT における新しいグレード分類
は、報告書にも新しい分類名を記
載しておりますので、ぜひご参考に
してみて下さい。細胞診に関する
記事についても検討してみます!
リンパ球免疫染色のみ依頼することは可能ですか。
◆スライドガラスのページにて、各スラ
イドガラスの使い分けがとても印象に
残りました。
千葉県・吉川様
お便りありがとうございます!スラ
イドガラスと一口に言っても、その
用途によってガラスの表面の加工
が異なっていたりと、とても奥が深
いです。スライドガラスの使い分け
は、綺麗な切片を作る上で欠かせ
ないですね。
ホームページが
新しくなりました!!
当社ホームページを全面的
にリニューアルいたしました!
今後も会社案内をはじめ、
検査のご案内やアマネセルの
新着情報などをより分かりや
すくお伝えしていけるよう、内
容を充実してまいります。当社
ホームページへのアクセス、
ぜひお待ちしております!
アマネセル
弊社の細胞診で悪性リンパ腫、悪性リンパ腫疑い
の診断が出たケースに関して免疫染色を承ってお
ります。細胞形態の確認も必要となりますので細胞
診検査と同時、もしくは細胞診検査後にご依頼願い
ます。
なお、お急ぎの場合には、細胞診検査の依頼時
に、免疫染色用の塗抹標本も同時にご送付いただ
き、「悪性リンパ腫の場合は免疫染色希望」と明記
いただけますとスムーズな検査が可能となります。
送信
※「塗抹標本作製器材セット」の詳細につきま
しては、弊社までお問い合わせください。
第 35 回
動物臨床医学会記念年次大会
に出展します!!
【日時】 2014 年 11 月 15 日(土)
∼16 日(日)
【会場】 大阪国際会議場
(グランキューブ大阪)
ブースを出展致します。多くの病院様と直
接お話しできることを楽しみにしておりま
す。学会へお越しの際は、ぜひ当社ブース
へもお立ち寄りください。
(業務部 伊藤雅人)
neues を発行してからちょうど 1 年が経ちま
す。様々な記事を載せていくうちに、皆様
にお伝えしたいことがたくさんあり、原稿を
削ることもたくさん
ありました…。しかし!
今回から neues の誌
面サイズが大きくなり
ました!今まで以上に
様々なことを思う存分
お伝えできると思いま
す!
これからも宜しくお願
い致します。 (樋口)
洞爺湖の紅葉