胃粘膜中のHelicobacter suis に対する

比較ゲノム解析を用いた、
胃粘膜中の Helicobacter suis に対する
新たな PCR プライマーの開発
抄　訳
魚谷　貴洋（ベイラー医科大学　医学部　消化器内科）、
山岡　吉生（大分大学　医学部　環境・予防医学、ベイラー医科大学　医学部　消化器内科）
Development of New PCR Primers by Comparative Genomics for the Detection
of Helicobacter suis in Gastric Biopsy Specimens
Hidenori Matsui,* Tetsufumi Takahashi,† Somay Y. Murayama,‡ Ikuo Uchiyama,§ Katsushi Yamaguchi,¶ Shuji Shigenobu,¶
Takehisa Matsumoto,** Masatomo Kawakubo,** Kazuki Horiuchi,** Hiroyoshi Ota,** Takako Osaki,†† Shigeru Kamiya,††
Annemieke Smet,‡‡ Bram Flahou,‡‡ Richard Ducatelle,‡‡ Freddy Haesebrouck,‡‡ Shinichi Takahashi,§§ Shinichi Nakamura¶¶
and Masahiko Nakamura†
*Kitasato
Institute for Life Sciences and Graduate School of Control Sciences, Kitasato University,
of Pharmaceutical Sciences, Kitasato University,
‡School of Pharmacy, Nihon University,
§ Data Integration and Analysis Facility, National Institute for Basic Biology,
¶ Functional Genomic Facility, National Institute for Basic Biology,
**School of Health Sciences, Shinshu University School of Medicine,
††Department of Infectious Diseases, Kyorin University School of Medicine,
‡‡Department of Pathology, Bacteriology and Avian Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, Ghent University,
§§Third Department of Internal Medicine, Kyorin University School of Medicine,
¶¶ Institute of Gastroenterology, Tokyo Women’s Medical University
†School
要　約
背景：Helicobacter suis（H. suis ）は Helicobacter pylori（H. pylori ）と比較して、感染率こそ有意に低
いが、胃 MALT リンパ腫と強い関連があるとされている。H. suis の培養は依然困難であるうえに、感染者
は尿素呼気試験で陰性を示すこともある。
対象と方法：雌 C57BL/6J マウスに、カニクイザルから得られた H. suis TKY 株および鳥肌胃炎患者か
ら得られた SNTW101 株を含むマウス胃粘膜破砕物をそれぞれ経口接種させた。TKY 株と SNTW101 株
の高純度 DNA サンプルは、感染マウスの胃粘膜から抽出した。H. suis の特異的塩基配列を検出するため
に、SOLiD 次世代シークエンサーで 20 種の Helicobacter 属と 11 種の Campylobacter 属のゲノムを比較し
た。
結果：C57BL/6J マウスは、TKY 株を含む胃粘膜破砕物の経口接種を行うことで胃 MALT リンパ腫を、
SNTW101 株の場合には、胃リンパ濾胞の形成を認めた。H. suis 6 株の解析で、2 つの保存配列が認めら
れ、H. suis 診断用 PCR プライマー作成に使用された。
結論：C57BL/6J マウスにおいて、H. suis 感染と胃病変に強い関連性が認められた。H. suis 特異的プ
ライマーを用いた PCR 診断法は、胃生検検体から H. suis を検出するために有用であった。
キーワード：Helicobacter suis 、次世代シークエンス、比較ゲノム解析、胃生検検体、感染マウスモデル、
PCR 診断
対象と方法
我々は、カニクイザルから分離した Helicobacter
© 2014 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 19: 260–271
24
suis（H. suis ）TKY 株と、鳥肌胃炎の 33 歳日本女
性患者から分離した H. suis SNTW101 株に対し、
in C57BL/6J mice [3,25–28,42,43]. Similarly, H. suis
SNTW101 isolated from a patient suffering from nodular gastritis induced a gastric disorder in C57BL/6J mice.
The chromosomal DNA from each of the isolates H. suis
As shown in Fig. 1, 20 months after inoculation with
HS5, H. heilmannii s.s., H. felis, H. baculiformis, H. bizzogastric mucosal homogenates containing H. suis
zeronii, H. cynogastricus, H. mustelae, H. salomonis, or
SNTW101, several round protrusive lesions in the fundic
H. pylori cultured in the
broth;
cellular
DNA
from
the
比較ゲノム解析を用いた、胃粘膜中の Helicobacter suis に対する新たな PCR プライマーの開発
gastric mucosa of mice infected with each of H. suis
TKY, SNTW101, SH8, or SH10; and cellular DNA from
全ゲノムシークエンスを行った。さらに胃
MALT
リ
each
gastric biopsy specimen (14 patients with
nodular
A
B
gastritis
including
four
UBT-negative
and
10
UBT-posiンパ腫患者から SH8 株と、慢性胃炎患者から
tive cases) were extracted using a DNeasy Blood & TisSH10
を分離Dusseldorf,
して対照Germany)
とした。according
これら 4toつthe
の
sue
kit 株
(Qiagen,
manufacturer’s
protocol.
H. suis をそれぞれ雌 C57BL/6J マウスで保持し、
Preparation of Template DNA for PCR Diagnosis
3 ～ 6 カ月後に生後 5 週の非感染マウスへ胃粘膜破
PCR Diagnosis
砕物を接種させた。感染マウスモデルは 20 カ月後
C
D
PCR was performed with a Mastercycler ep (Eppendorf
に屠殺し、組織学的検討を行った。胃粘膜破砕物
AG, Hamburg, Germany) using Tfi DNA polymerase
は非特異的な吸着を避けるため、ウサギIgG
で覆わ
(Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) and the following
two
or three primer pairs: VAC3624F/VAC4041R for the
れた磁性ビーズで処理されたセルストレーナーで濾
vacA gene of H. pylori [13]; HH-F5/HH-R4 for the non過して凝集塊を取り除いた。その後、懸濁液はウ
coding
region; and/or carR2F/carR2R for the carR gene
of
H.
suis
(Table 1).
The assay mixture contained, in a
サギ抗 H. pylori
抗体で覆われた磁性ビーズで処理
final volume of 25 lL, 19 PCR reaction buffer, 200 lM
された。なお、DNA
純度測定は
SYBR
green
of
each dNTP, 1.5 mmol/L
MgCl2, 0.2
lM of
eachを用
primer
pair, 10 ngPCR
of chromosomal
いた real-time
で行った。 DNA (H. suis HS5,
H. heilmannii s.s., H. felis, H. baculiformis, H. bizzozeronii,
全ゲノム解析は SOLiD シークエンサーで行った。
H. cynogastricus, H. mustelae, H. salomonis, and H. pylori)
or
100 ng of cellular
DNAバーコードフラグメントライ
(from mouse gastric mucosa
フラグメントは
SOLiD
infected with H. suis or from gastric biopsy specimens),
Figure
1 A）コントロールの肉眼所見、
Representative macroscopic view（B）SNW101
of the stomach of 株接種
an age図 1．（
matched20
control
(A) and a gastric homogenate-containing
Helicobacter
カ月後のマウスの肉眼所見、
（C）コントロールの顕
suis SNTW101-inoculated
mouse (B) 株接種
at 20 months
post-inoculation.
微鏡所見、（D）SNW101
20 カ月後のマウスの
The representative
microscopic
appearance
of
the
H&E-stained
stom顕微鏡所見。矢印は突出部位（B）とリンパ濾胞（D）
ach sections
of an age-matched control (C) and an H. suis SNTW101を示す。
infected mouse (D) at 20 months post-inoculation is also shown (original magnification, 9100). Arrows indicate the round protrusive lesions
(B) and lymphoid follicle (D).
SOLiD 4 で 50 + 35 bp の paired-end-read が得ら
たところ、20 カ月後にリンパ濾胞の形成が認めら
れた。SOLiD
シークエンサーから得た
color-space
©
2014 John Wiley & Sons
Ltd, Helicobacter 19: 260–271
れた（図 1）。一方、非感染マウスには病変を認め
263
reads は SOLiD de novo accessory tools v.2.0 でア
なかったことから、先の TKY 株同様に、SNTW101
センブリングされた。デフォルトのパラメータで設定
株は胃病変を誘発する可能性が示された。
ブラリーで emulsion PCR が行われ、最終的に
されたアセンブリングは非常に短いコンティグであっ
予備実験において、経口感染後のマウスの胃粘
たため、いくつかのアセンブリパラメータの組み合わ
膜に多量の Lactobacillus species を認めた。これ
せをテストし、最長のコンティグサイズを選んだ。
に対し、抗 Helicobacter pylori（H. pylori ）抗体で
アセンブリングされたコンティグ配列は、FASTA で
コーティングした磁気ビーズを用いることにより、
H. suis HS1 株と HS5 株の公式コンティグ配列と比
サンプルへのマウス胃粘膜細胞や他の細菌の混入
較した。さらにアセンブリングされた配列の遺伝子
の割合を効果的に減少させた。サンプルの最終
を同定するために、Helicobacter 20 株および
H. suis 純度は 30 ～ 60％となり、シークエンスが十
Campylobacter 11株に対して、BLASTXをかけた。
分に可能となった。
オルソロジー分析は、Research environment for
シークエンスで得られた塩基配列に対し、
comparative genomics（RECOG）システムを用いて
Helicobacter 20 株および Campylobacter 11 株で
行った。
比較ゲノム解析を行ったところ、H. suis の 2 つの保
結　果
存配列を認めた。これらの配列が実際のところ
H. suis に特異的か否かを決定するために、プライ
我々は、カニクイザルから分離した H. suis TKY
マーを作り、PCR 法で確認した。HH-F5/HH-R4
株が、C57BL/6J マウスに胃 MALT リンパ腫を引
プライマーと caR2F/carR2R プライマーは H. suis
き起こすことを報告してきた。同様に C57BL/6J
（TKY 株、SNTW101 株、SH8 株、SH10 株、HS5
マウスに対して、鳥肌胃炎の患者から分離した
株）において、標的部位を特異的に増幅させたが、
SNTW101 株を含む胃粘膜破砕物を経口接種させ
その他の Helicobacter 属（H. pylori 、H. heilmannii
25
Figure 4 Comparison of Helicobacter suis-specific arrangements of the carR gene. The results of parallel DNA sequencing of the carR gene
among H. suis TKY, H. suis SNTW101, H. suis SH8, H. suis SH10, H. suis HS1 (EMBL/GenBank/DDBJ accession no. ADGY01000086.1, contig00086),
and H. suis HS5 (EMBL/GenBank/DDBJ accession no. ADHO010000186.1, contig00186) are shown. The DNA sequences of H. suis TKY, SNTW101,
SH8, and SH10 were determined after the PCR amplification using the primer pair carRUP/carRDW (Table 1). For the diagnostic PCR, the primer
pair carR2F/carR2R was enclosed and indicated.
A
B
Figure
5 Evaluation
of the PCR
PCR primers
used to amplify the target DNA fragments from Helicobacter suis. (A) Lane M shows a 100-bp DNA ladder,
図
2．H. suis
に対する
プライマーの評価　and lanes 1–18 show the PCR products made from the template DNA, as follows; lane 1, uninfected mouse gastric mucosa (100 ng); lane 2,
（A）Lane M、100-bp DNA ladder；lane 1、非感染マウス胃粘膜検体；lane 2、H. suis TKY 株感染マウス胃粘膜検体；
H. suis TKY-infected mouse gastric mucosa (100 ng); lane 3, H. suis SNTW101-infected mouse gastric mucosa (100 ng); lane 4, H. suis SH8-infected
lane 3、SNTW101 株感染マウス胃粘膜検体；lane 4、SH8 株感染マウス胃粘膜検体；lane 5、SH10 株感染マウス胃粘
mouse gastric mucosa (100 ng); lane 5, SH10-infected mouse gastric mucosa (100 ng); lane 6, H. suis HS5 (10 ng); lane 7, Helicobacter heilmannii
膜検体；lane
6、HS5
株；lane
Helicobacter
heilmannii
s.s. ASB1.4；lane
8、Helicobacter
ATCC bizzozeronii
49179；
s.s. ASB1.4
(10 ng); lane
8, Helicobacter
felis7、
ATCC
49179 (10 ng);
lane 9, Helicobacter
baculiformis M50
(10 ng); lane 10,felis
Helicobacter
lane
Helicobacter
baculiformis
10、
Helicobacter
bizzozeronii
R1051；lane
Helicobacter
R1051 (10
ng);9、
lane
11, Helicobacter
cynogastricus M50；lane
JKM4 (10 ng); lane
12,
Helicobacter mustelae
NCTC 12032
(10 ng); lane11、
13, Helicobacter
salocynogastricus
JKM4；lane
Helicobacter
monis R1053
(10 ng); lane 14,
Helicobacter 12、
pylori Helicobacter
SS1 (10 ng); lane mustelae
15, H. pylori NCTC
TN2GF4 12032；lane
(10 ng); lane 16, H.13、
pylori
NCTC 11637 (10salomonis
ng); lane 17,
Helicobacter
pylori
15、
16、
H. pylori
NCTC
11637；
H. pyloriR1053；lane
ATCC 43579 (10 14、
ng); and
lane 18, H. pylori
RC-1SS1；lane
(10 ng). (B) Lane
MH. pylori
shows a TN2GF4；lane
100-bp DNA ladder, and
lanes
1–16 show
the PCR
products
lanethe
17、
H. pylori
18、H. pylori
RC-1.（B）
Lane
100-bp
DNA
1、
made from
template
DNA, asATCC
follows;43579；lane
lane 1, H. suis TKY-infected
mouse
gastric mucosa
(100 M、a
ng); lane
2, H. pylori
SS1ladder；lane
(10 ng); lanes 3–8,
age-matched
uninfected
mouse gastric mucosa (100 ng); and
9–16, H.
suis SNTW101-infected
mouse gastric mucosa (100 ng), 209–16、
months
H. suis
TKY 株感染マウス胃粘膜検体；lane
2、lanes
H. pylori
SS1；lanes
3–8、非感染マウス胃粘膜検体；lanes
post-inoculation.
indicate
the amplified DNA bands using the primer pairs VAC3624F/VAC4041R (418 bp, vacA gene of H. pylori), HH-F5/
H. suis Arrows
SNTW101
株感染マウス胃粘膜検体。矢印はそれぞれのプライマーによるバンドの位置を示す。VAC3624F/
HH-R4 (348
bp, noncoding regionbp、vacA
of H. suis), and
carR2F/carR2R
(220）、HH-F5/HH-R4
bp, carR gene of H. suis).
VAC4041R（418
gene
of H. pylori
（348 bp、noncoding region of H. suis ）、
carR2F/carR2R（220 bp、carR gene of H. suis ）。
s.s .、H. felis 、H. baculiformis 、H. bizzozeronii 、
胃生検検体において H. suis の診断確定に有用であ
H. cynogastricus 、H. mustelae ）では増幅はみられ
ることが示された。
なかった（図2A、lanes 2 ～ 13）
。一方、VAC3624F/
Figure 6 PCR detection of Helicobacter suis in gastric biopsy specimens. Diagnostic PCR detection of Helicobacter
考　察 in gastric biopsy specimens of
pairs Vac3624F/Vac4041R and carR2F/carR2R. Lane M shows a 100-bp
DNA ladder, and lanes
1–16
show
the PCR
made
from the templateC57BL/6J
DNA, as follows:
lane 1, Helicobacter pylori SS1
(10 ng); lane 2,
域を増幅させた
（図
2A
、lanes
14products
～ 18）
。HH-F5/
マウスモデルは、TKY
株感染マウス
H. suis TKY-infected mouse gastric mucosa (100 ng); and lanes 3–16, prepared from gastric biopsy samples (100 ng). Arrows indicate the DNA
HH-R4
と carR2F/carR2R
のプライマーを用いるこ
の胃粘膜(220
破砕
bands amplified
using the primer pairs
VAC3624F/VAC4041R (418 bp) and carR2F/carR2R
bp).物の経口接種させることにより
VAC4041R
プライマーは H. pylori DNA の特定領
patients with nodular gastritis was carried out using the specific primer
とにより、SNTW101 株感染 20 カ月後のマウスの
MALT リンパ腫を発症したが、非感染マウスの胃
U2235R [46]. Recently, a new quantitative real-time
胃粘膜からは特定領域の増幅は明らかであり検出
PCR method was developed to detect H. suis using the
可能であった
（図of2B
、lanes 9 ～
が、非感染マ
ureA primer pair
BF_HsuisF1
and16）
BF_HsuisR1
[47].
Indeed,
the
target
DNA
fragments
of
ureA
genes
from
ウスでは検出されなかった（図 2B、lanes 3 ～ 8）
。
H. suis strains TKY, SNTW101, SH8, and SH10 were
尿素呼気試験
陰性患者
図3
、lanesThese
3～
amplified
by this（UBT）
PCR system
(data（not
shown).
results
led
to
the
conclusion
that
despite
the
presence
of
5、16）と UBT 陽性患者（図 3、lanes 6 ～ 15）から
urease genes, the urease activity in stomach tissue was
undetectable in H. suis SNTW101. Moreover, not only
H. suis SNTW101 but also other urease-negative H. suis
と同様に
SNTW101
株も、仮に他の細菌が胃粘膜
strains have
been detected
in gastric biopsy specimens
from
UBT-negative
patients
[9,16]. So far, there is no
破砕物の中に存在していたとしても、リンパ濾胞の
clear answer as to how urease-negative H. suis strains
形成を引き起こすであろうことが予想された。
can colonize in the mouse and human stomachs.
We have been attempting to develop new PCR assay
磁気粒子は、生物工学と医学の両分野において
systems for the detection of H. suis in gastric biopsy
VAC4041R プライマーと carR2F/carR2R プライ
ンのように生理活性分子を伴った粒子は、細胞分離
268ーは、H. pylori 感染群（図 3、lanes 6 ～ 15）
マ
、
© 2014
& Sons
Ltd, 量
Helicobacter
19: 株
260–271
に有用である。
本John
研 Wiley
究で
は少
の TKY
と
H. suis 感染群（図 3、lanes 16）、H. suis 非感染群
SNTW101 株（＜ 1％）を、胃粘膜破砕物中の多く
（図 3、lanes 3 ～ 5）を明確に区別することができ
の腸管内微生物や宿主細胞などの他の細胞から、ウ
採取した検体で PCR 法を行った結果、VAC3624F/
た。以上により、carR2F/carR2R のプライマーは、
26
粘膜破砕物では胃病変を認めなかった。この結果
広く用いられており、特に抗体やストレプトアビジ
サギ抗 H. pylori 抗体を付着させた磁気ナノ粒子を
R1051 (10 ng); lane 11, Helicobacter cynogastricus JKM4 (10 ng); lane 12, Helicobacter mustelae NCTC 12032 (10 ng); lane 13, Helicobacter salomonis R1053 (10 ng); lane 14, Helicobacter pylori SS1 (10 ng); lane 15, H. pylori TN2GF4 (10 ng); lane 16, H. pylori NCTC 11637 (10 ng); lane 17,
H. pylori ATCC 43579 (10 ng); and lane 18, H. pylori RC-1 (10 ng). (B) Lane M shows a 100-bp DNA ladder, and lanes 1–16 show the PCR products
made from the template DNA, as follows; lane 1, H. suis TKY-infected mouse gastric mucosa (100 ng); lane 2, H. pylori SS1 (10 ng); lanes 3–8,
age-matched uninfected mouse gastric mucosa (100 ng); and lanes 9–16, H. suis SNTW101-infected mouse gastric mucosa (100 ng), 20 months
post-inoculation. Arrows indicate the amplified DNA bands using the primer pairs VAC3624F/VAC4041R (418 bp, vacA gene of H. pylori), HH-F5/
HH-R4 (348 bp, noncoding region
of H. suis), and carR2F/carR2R (220 bp, Helicobacter
carR gene of H. suis).
比較ゲノム解析を用いた、胃粘膜中の
suis に対する新たな PCR プライマーの開発
図 3． 6胃生検検体における、PCR
法による
H. suis
の検出　Figure
PCR detection of Helicobacter
suis in gastric
biopsy
specimens. Diagnostic PCR detection of Helicobacter in gastric biopsy specimens of
patients with nodular gastritis was carried out using the specific primer pairs Vac3624F/Vac4041R and carR2F/carR2R. Lane M shows a 100-bp
Vac3624F/Vac4041R プライマーと carR2F/carR2R プライマーを用いて、鳥肌胃炎の患者の胃生検検体を PCR 法で
DNA ladder, and lanes 1–16 show the PCR products made from the template DNA, as follows: lane 1, Helicobacter pylori SS1 (10 ng); lane 2,
解析した。Lane M、100-bp DNA ladder、: lane 1、H. pylori SS1；lane 2、H. suis TKY 株感染マウス胃粘膜；
H. suis TKY-infected mouse gastric mucosa (100 ng); and lanes 3–16, prepared from gastric biopsy samples (100 ng). Arrows indicate the DNA
lane 3 ～ 16、胃粘膜検体。図 2 と同様に、矢印はそれぞれのプライマーによるバンドの位置を示す。
bands amplified using the primer pairs VAC3624F/VAC4041R (418 bp) and carR2F/carR2R (220 bp).
U2235R [46]. Recently, a new quantitative real-time
PCR method was developed to detect H. suis using the
ureA
primer pair of BF_HsuisF1 and BF_HsuisR1 [47].
用いて、分離することに成功した。つまりこの方法
Indeed, the target DNA fragments of ureA genes from
を用いることにより、
H. pylori SH8,
以外の
Helicobacter
H.
suis strains TKY, SNTW101,
and
SH10 were
amplified
by this PCR system (data not shown). These
属を分離培養する必要がなくなる可能性が示され
results led to the conclusion that despite the presence of
た。免疫磁気分離法と PCR を組み合わせは、ヒト
urease genes, the urease activity in stomach tissue was
や動物組織の培養不可能な Helicobacter 属を検出
するための有用な方法になりうるであろう。
undetectable in H. suis SNTW101. Moreover, not only
H. suis SNTW101 but also other urease-negative H. suis
strains
have been detected H. suis
in gastric
biopsy specimens
感染マウス胃粘膜からも
を同定することに
from UBT-negative patients [9,16]. So far, there is no
成功した。加えて我々は
VAC3624F/VAC4041R
clear
answer as to how urease-negative
H. suis strains
can
colonize incarR2F/carR2R
the mouse and human
stomachs. PCR
プライマーと
のプライマーで
We have been attempting to develop new PCR assay
を行うことにより、ヒト胃粘膜生検検体でH. pylori
systems for the detection of H. suis in gastric biopsy
感染と H. suis 感染を区別できることを証明した。
鳥肌胃炎の患者から分離した SNTW101 株と、
268
我々は、16S rRNA やウレアーゼ遺伝子以外の
長期感染マウスモデルの胃リンパ濾胞形成には、強
H. suis 特異的プライマーを用いて、胃検体から
い相関を認めた。一方、過去には、TKY 株を含む
H. suis を検出する新しい PCR 法の開発を試みてき
胃粘膜破砕物の接種は比較的短期間で胃 MALT リ
た。その結果、TKY 株、SNTW101 株、HS1 株、
ンパ腫を引き起こしたという報告や、ブタから分離
HS5 株のゲノムをシークエンスし、H. pylori に反
された H. suis 株感染はマウスとスナネズミに胃病
応せずに H. suis のみ検出できる 2 つのターゲット領
変を発症させたという報告がある。H. suis の病原
域を明らかにした。これらより HH-F5/HH-R4 プラ
性の差異を明らかにするためには、感染実験にのみ
イマーと caR2F/carR2R プライマーを作成したとこ
ならず、さらなる比較ゲノム解析が必要であろう。
© 2014 John Wiley & Sons Ltd, Helicobacter 19: 260–271
ろ、H. suis 株の DNA 特定領域は増幅され、さらに
著者らは全ゲノム解析と比較ゲノム解析を用いて
パ腫やパーキンソン病との関連が示唆されているが、
Helicobacter suis（H. suis ）に対する特異的プライ
ウレアーゼ産生能が弱いこともあり、診断が困難で
マーを設計し、感染マウスモデルやヒト胃粘膜生検検
あった。本研究は、PCR 法という比較的簡便な手法
体において、Helicobacter pylori（H. pylori ）と区別
でその診断を身近なものとしたことに加え、ゲノム解
して H. suis を検出できることを証明した。H. suis
析を用いたプライマーの設定法も非常に興味深く、今
は H. pylori と同様もしくは、より高度に MALT リン
後の参考になる有意義な研究と考えられた。
27

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