製品特集再生医療へつながる幹細胞培養の最新テクノロジー新しい技術はサイエンスの発展を加速させますが，そのような技術開発には企業が大きく貢献しています．そこで「製品特集」コーナーでは最新のテクノロジーに注目し，第一線のアカデミア研究者にサイエンスの動向をレビューいただくとともに，開発側の各企業には具体的な製品やサービス，アプリケーション例をご紹介いただきます．今回，再生医療をめざした細胞外環境の知見に基づく幹細胞培養や，立体組織構築のための技術の最前線にフォーカスします．＜ Review ＞再生医療の実現に向けた幹細胞培養技術の開発　中川誠人……… 2958 ＜協賛企業記事＞株式会社ニッピ… ……………………………… 2964 ＜協賛企業＞株式会社高研三洋貿易株式会社株式会社ニッピ　（五十音順）〈Review〉再生医療の実現に向けた幹細胞培養技術の開発中川誠人幹細胞を臨床応用するには品質が十分に担保された安全な細胞をつくることが必要である．そのためには，われわれは培養システムが一番重要であると考え，真に応用可能な培養液やコーティング剤の開発を進めてきた．幹細胞の応用は今まさにはじまったところであり，今後の発展に向けて，さらなる改良が必要である．多能性幹細胞には ES 細胞や iPS 細胞がある．iPS 細胞は自分の体の細胞からつくり出せる細胞で，細胞移植治療や創薬などのオーダーメイド医療への活用が期待されている．本稿では ES/iPS 細胞培養技術の現状と今後の展開について考えてみたい．はじめに他の解説を参照していただきたい．幹細胞はわれわれの体を構成するさまざまな細胞へと分化する能力をもっている．このような特徴から，ヒト多能性幹細胞の培養技術病気や怪我で失われた細胞を補完する移植治療への応背景と歴史用が期待されている．本稿ではヒト多能性幹細胞であヒト ES/iPS 細胞の培養はフィーダー細胞との共培養る ES 細胞および iPS 細胞の培養技術の最新情報と今後系で行われてきた．フィーダー細胞を用いることでヒの医療への応用について説明する．なお，幹細胞にはト ES/iPS 細胞が状態良く培養できる 1）2）．ヒト ES/iPS 体性幹細胞という医療応用に有用な細胞も存在するが，細胞のための培養液（培地）は血清代替物と数種類の Development of stem cell culture system for regenerative medicine Masato Nakagawa：Department of Life Science Frontiers, Center for iPS cell Research and Application, Kyoto University （京都大学 iPS 細胞研究所未来生命科学開拓部門） 2958 実験医学　Vol. 33　No. 18（11 月号）2015 ＜ Review ＞　再生医療の実現に向けた幹細胞培養技術の開発サイトカイン・成長因子などで構成されている．フィー要となる．また，使うときに毎回同じ細胞の状態にすダー細胞の培養にはウシ胎仔血清（F B S）を含んだ培ることは難しく，ES/iPS 細胞の性状に影響することは養液を用いられている．明白である．ヒト ES/iPS 細胞の培養に使われているフィーダー細胞の多くはマウス胎仔線維芽細胞の初代培養細胞，あるいはそれらを株化した細胞が使われている．他には，最新の細胞培養技術 Feeder-free でのヒト ES/iPS 細胞の培養ヒト細胞をフィーダー細胞として用いることも可能でわれわれは臨床応用可能なES/iPS 細胞の培養法の開あることが報告されている 3）．フィーダー細胞を使用発をはじめた．規制をクリアすることはもちろんだが，するときの注意点としては，毎回同じ状態のフィーダー臨床用細胞を準備する（製造する）現場で運用しやす細胞を準備することである．そうでないと ES/iPS 細胞い方法であることをめざした．これまで研究目的で利の状態にも影響が出てしまう．用していたフィーダー細胞を用いた培養方法では限界これらの培養条件はヒト ES/iPS 細胞を基礎研究の中で使うために築き上げられてきたものである． 4）があると考え，フィーダーフリーの培養方法（feederfree 法，Ff 法）の開発を行うことを決めた．また，培養液などの試薬類には生物由来原料基準に則ったものヒト ES/iPS 細胞の臨床応用と培養の課題を使用することとした．細胞移植治療を考えた場合，患者の体に入る分化細われわれがフィーダー細胞の代わりになる基材（コー胞のもとになる細胞がヒト ES/iPS 細胞であることかティング材）を探していたときに laminin-511 という細ら，臨床応用に適した細胞にする必要がある．適した胞外マトリクスのタンパク質がヒト ES/iPS 細胞の培養細胞とは質はもちろん重要だが，ここでは培養方法のに有効であることが報告された 5）．国内では，大阪大点から考えてみたい．学の関口清俊教授が一歩進んだ同様の研究を行ってお ES/iPS 細胞由来の分化細胞を使って臨床応用を行うり，laminin-511 の活性断片を用いたヒト iPS 細胞の培には，治療の安全性を担保するためのルールを遵守す養に関する共同研究を開始した 6）7）．検討の結果，このる必要がある．厚生労働省が出している「生物由来原 laminin-511 の活性断片がヒト iPS 細胞の樹立から維持料基準」はその 1 つであり，「医薬品等の品質，有効性培養までコーティング剤として有効であることがわかっ及び安全性を確保することを目的とする」，と冒頭に書た（表）．現在では，iMatrix-511 という製品名で販売かれている．ES/iPS 細胞の場合，安全が担保された培されている〔㈱ニッピ〕．養液やフィーダー細胞を使わなくてはならないということになる．次に，laminin-511 の活性断片をコーティング剤に用いたときに最高のパフォーマンスを発揮する培地の開動物由来の成分，例えば FBS や血清代替物などは使発をはじめた．ヒト ES/iPS 細胞の未分化能を維持する用できないわけではないが，未知のウイルスのリスクためには bFGF などのいくつかの成長因子が必要であなどを考慮するとできるだけ量を減らすか，使わないることが報告されていた 8）9）．他にも細胞の生存，培地ことが望ましい．使用する場合は採取元の動物の飼育の安定化に必要な因子をリストアップし，それぞれの環境から製品の製造，出荷工程まで，そして製品その濃度と組み合わせを検討した． 300 もの候補培地の検ものの安全性などに関して膨大な資料を準備する必要討からプロトタイプの培地が完成し，ヒト ES/iPS 細胞がある．の培養に有効であることが確認できた．プロトタイプフィーダー細胞を用いる場合は，セルバンクを構築では動物由来成分を含んでいたため，一つひとつの成する必要があると考えられる．セルバンクの構築には分を組換タンパク質などの非動物由来成分に変更して細胞調製施設（クリーンルーム）で大量の凍結ストッいった．最終的にStemFit AK03〔味の素㈱との共同開クの作製が必要である．また，詳細なウイルス試験も発〕という培養液の開発に成功した（表）．この培養液行うため，最終的にかなりの労力，時間とコストが必は独立行政法人医薬品医療機器総合機構（P M D A）実験医学　Vol. 33　No. 18（11 月号）2015 2959 製品特集表　フィーダーフリー培養法の特徴フィーダーフリー法フィーダー法支持細胞／基質 iMatrix-511（組換えラミニンタンパク質）〔㈱ニッピ〕マウス SNL 細胞（マイトマイシン処理）培地 StemFit AK03（生物由来原料を含まない）〔味の素㈱〕動物由来成分を含む血清を含む播種シングルセル→カウントして一定数を播種小さめの塊にして播種継代率 1：100 1：3 培地交換一日おきほぼ毎日凍結保存 STEM-CELLBANKER 緩慢法（－80 ℃） DAP213 ガラス化法（液体窒素）新たに開発したフィーダーフリーの培養法と従来法（フィーダー法）の比較表．との対面助言において生物由来原料基準の適用対象外と考える．医療グレードの iPS 細胞の場合はさらにハーであるという見解を得ている．つまり，臨床応用に用ドルが上がってしまう．ここでは，i P S 細胞の最大のいるにあたって同意を得ることができたと考えている．メリットである自己多能性幹細胞の活用を近い将来実 iMatrix-511 も同様に PMDA による同意を得ている．現させるためのポイントについて考えてみたい．新たに開発したFf 培養法とこれまでの培養法（フィーダー法）の比較を表に示したまずは i P S 細胞をつくるうえで一番重要な初期化の．コーティング剤と培ステップに関して問題となっているのは，誘導効率が地は前述の通りである．Ff 培養法では細胞のコロニー低いことである．体細胞に初期化因子を導入することを完全にバラバラにし，シングルセルにした後に播種で i P S 細胞への誘導を行うが，そのときにベクターとする方法で継代を行っており，細胞の数をカウントし，いう遺伝子の運び屋を使うことが一般的である．ベク一定数の細胞を播種できることがメリットである（図ターを使用する際に重要なことは，初期化される細胞 1）．このことにより，作業者間，施設間でのばらつきのゲノムにベクターが入り込まないこと（非挿入）でを減らせることが期待され，運用でのメリットは大きある．つまり，ゲノムに変化を起こさないということいと考えられる．継代率は 1：100 とこれまでの方法をが重要である．われわれは現在，エピソーマルベクター大きく上回っており，容易に大量培養を行うことが可というものを主に使用している 11）12）．ヒト iPS 細胞を能となった．培地交換は 2 日に一度で十分であること樹立した当初に用いていたレトロウイルスとは異なり，を確認しており，作業者の負担軽減につながることもエピソーマルベクターを用いた場合は導入遺伝子がホ大きな利点である．凍結保存は市販の試薬 S T E M - ストゲノムに組み込まれることがほとんどないことが CELLBANKER〔日本全薬工業㈱〕を用いて，－80 度知られている．また通常のプラスミドベクターとは違での緩慢法で行えるため，一度に多量のストックを作い，細胞分裂に伴って導入遺伝子が複製される特徴か製する場合にも有用である．ら，iPS 細胞の樹立に有効であることがわかっている． 10）効率の点ではセンダイウイルスベクターが非常に有用未来の培養技術である 13）．また，RNA による初期化は非常に有用な技多能性幹細胞の培養に関して現状と未来について図術であるが，効率の点で今後の改良が期待される 14）． 2 にまとめた．現状では，よくても 1 ％程度の初期化効率であるので， i P S 細胞は自分自身の体の細胞からつくることがで将来的には 10 ％を超える効率の実現が望まれる．きるため，免疫拒絶反応のない移植治療のソースとし維持培養については，前述の Ff 培養法が有用と考えて期待されている．また，疾患 i P S 細胞を用いた病態る．この方法は臨床での使用も可能であることから，モデルの構築と創薬の進展は大いに期待される分野で基礎から臨床を一貫して同じ培養法で行えるのが大きある．しかしながら，個々人の i P S 細胞をつくるのになメリットである．培養試薬は大量に使用するためコは，コストと時間を考えると現状では技術的に難しいスト面が懸念材料であるので，十分なベネフィットが 2960 実験医学　Vol. 33　No. 18（11 月号）2015 ＜ Review ＞　再生医療の実現に向けた幹細胞培養技術の開発 0日目 1日目 2日目 3日目 4日目 5日目 6日目 7日目図 1 シングルセルでのヒト iPS 細胞の培養ヒト iPS 細胞のコロニーをシングルセルにし，新しい培養皿に播種した． 0 日目の矢頭が播種直後の 1 つの細胞を示す．経時的に観察することで，シングルセルから 7 日間で十分な大きさのコロニーを形成できることが確認できた．スケールバー＝ 300 μ m〔IncuCyteZOOM（エッセンバイオ）で撮影〕得られるかどうかを考慮する必要がある．今後はよりスに結合したり，多くの場合は両者の様式で何かにくっ安価で高性能な培地の開発が望まれる．コーティングついて増殖および分化をしていると考えられる．くっ剤に関しては，将来的に完全合成の物質で代替できるつくことによりさまざま刺激を受けており，この刺激ことが望まれる．が重要である．凍結保存については，試薬，凍結条件，長期保存，神経細胞への分化誘導では 96-well プレート（U 底）などさまざまな条件の改良が必要である．具体的には，にバラバラにした細胞を多数入れ込み，ボール様構造より安定した生存率を達成可能な凍結保存液，最適な（スフェア）をつくらせることでそのなかで神経細胞を凍結温度条件やそのための装置，より高温で長期保存つくることができる 17）18）．同様にスフェアをつくらせが可能な凍結保存容器，などについて技術の発展が望ることで拍動する心筋細胞をつくることができる．スまれる．フェアの形成により培地に触れる表面とその内側で細分化細胞をつくる直前の段階での大量培養は応用に胞の性質に違いが出てくることで，さまざまな細胞へ向けて克服しないとならない重要な技術である．スピの分化誘導が可能となっている．細胞外シグナルの種ナーフラスコなどを用いた浮遊培養系が主流であると類（＝培地に含まれる成分など）により内部の細胞社考えられるが，他にはバッグ培養系でも大量培養が可会の行く末が決まってくることは興味深い現象である．能である．ポイントは均質な細胞を培養できること最近ではラミニンなどの細胞外マトリクスに接着させである．最近では培養装置だけでなく培養を安定させて，平面培養で神経細胞や心筋細胞をつくることもでる試薬の開発など総合的な開発が進んでおり，将来的きるようになり，より目的の細胞にフォーカスした分に工場規模で稼働させることが可能な技術の開発が望化誘導が可能となってきている 19）． 15）まれる 16）．多能性幹細胞から体細胞を分化誘導する研究におい ES/iPS 細胞などの多能性幹細胞から分化細胞をつくての最終目標は組織構築ではないだろうか．組織は多るときの培養方法についても簡単に考えてみたい．細種類の細胞からなる複雑な構造をしている．組織を構胞はシングルセルで培地のなかに浮いたままでは上手成する多種類の細胞をそれぞれつくるのは現在の技術く分化することは難しい．体のなかをみるとわかるよでは難しい．効率，純度，成熟度，性質，などわれわうに，他の細胞とくっついていたり，細胞外マトリクれにはほとんど制御することはできない．しかし，最実験医学　Vol. 33　No. 18（11 月号）2015 2961 製品特集 iPS 細胞初期化重要なポイント分化細胞の製造未分化細胞の製造体細胞（血液など）ゲノムへの非挿入維持培養フィーダーフリー・ゼノフリー凍結拡大培養緩慢法（−80℃）大量培養現状で使われている技術（試薬など）エピソーマルセンダイウイルス RNA レトロウイルスなど iMatrix-511 STEMStemFit AK03 CELLBANKER Vitronectin プログラム TeSR2 などフリーザなどスピナーフラスコ培養バッグ安定化剤など今後の改良において重視されるべきポイント高効率短期間安定性操作の簡略化均質性高密度化高い生存率操作の簡略化自動化自動化 ▪個別化医療に向けたハイスループットでの iPS 細胞の樹立・維持培養装置の自動化 ▪高い生存率・長期保存安定性・自動化を可能とする凍結システムの開発 ▪大量培養から目的分化細胞の製造までの一連の作業の自動化 ▪大量生産した分化細胞を使ったハイスループットスクリーニング技術の開発図 2 ヒト iPS 細胞の培養技術の現状と今後 i P S 細胞技術を応用するためには，血液などの体細胞を初期化し，維持培養し，凍結ストックを作製し，大量培養して必要な分化細胞を準備する必要がある．それぞれのステップにかかわる事項をこの図に示した．近の研究成果により自己組織化による組織構築技術がこれらは細胞移植治療であるが，別の方向として i P S 発展してきている．この技術では，細胞の集まりが自細胞技術を使った創薬研究が非常に活発である．大学然にさまざまな細胞へと分化し，組織が構築される．と企業が連携して新たな薬を開発しようとする動きが ES 細胞を使って眼杯様組織や小脳神経組織の構築が報随所でみられる．告されている．自己組織化による分化誘導には外少し先を考えたときに，移植治療でも創薬でも自己部環境（＝培地構成成分など）を上手に整えることが i P S 細胞を使った応用の実現が望まれることは間違い大切である．ないと考える．自己細胞移植であれば免疫拒絶反応の 20）21）分化誘導技術は基本的に発生における組織や細胞のリスクはかなり低いことから，大きな治療効果を得る分化を模倣しており，細胞がもともともっている能力ことも可能であろう．また，自己 i P S 細胞からさまざを上手く引き出していることになる．自己組織化技術まな分化細胞をつくり，さまざまな薬の効果を検討すはその際たるものであると考えられる．今後は発生なることで本当の意味でのオーダーメイド医療が実現でどの基礎研究を基盤とした分化誘導培養技術の発展がきるのではないだろうか．現在発展が著しいゲノム編期待される．集技術と組合わせることで，異常細胞を人為的につくり，病態モデルを使った先行的ドラッグスクリーニン今後の展望グも可能である．細胞での結果とそれを人体に適用し本稿ではヒト ES/iPS 細胞の培養技術について現状と今後について述べてきた．たときの効果がどれほど合致するかは今後の研究データの蓄積が必要な点である．同時に，国内のロボット国内ではヒト iP S 細胞を使った臨床研究がすでにはじまっており，今後はいろいろな疾患に対して i P S 細技術などを活用した自動培養装置の開発が必須であり，今後の発展が非常に期待される．胞を使った臨床研究が行われることが期待されている． 2962 実験医学　Vol. 33　No. 18（11 月号）2015 ＜ Review ＞　再生医療の実現に向けた幹細胞培養技術の開発文献 18）Eiraku M & Sasai Y：Nat Protoc, 7：69-79, 2011 19）Doi D, et al：Stem Cell Reports, 2：337-350, 2014 1） Takahashi K, et al：Cell, 131：861-872, 2007 20）Eiraku M, et al：Nature, 472：51-56, 2011 2） Takahashi K & Yamanaka S：Cell, 126：663-676, 2006 21）Muguruma K, et al：Cell Rep, 10：537-550, 2015 3） Takahashi K, et al：PLoS One, 4：e8067, 2009 4） Suemori H, et al：Biochem Biophys Res Commun, 345： 926-932, 2006 Profile 5） Rodin S, et al：Nat Biotechnol, 28：611-615, 2010 6） Miyazaki T, et al：Nat Commun, 3：1236, 2012 7） Ido H, et al：J Biol Chem, 282：11144-11154, 2007 8） Levenstein ME, et al：Stem Cells, 24：568-574, 2006 9） Xu RH, et al：Nat Methods, 2：185-190, 2005 中川誠人 10）Nakagawa M, et al：Sci Rep, 4：3594, 2014 1997 年，上智大学理工学部化学科卒業．2002 年，奈 11）Okita K, et al：Stem Cells, 31：458-466, 2013 良先端科学技術大学院大学にて博士号取得（バイオサイ 12）Okita K, et al：Nat Methods, 8：409-412, 2011 13）F usaki N, et al：Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 85： 348-362, 2009 14）Warren L, et al：Cell Stem Cell, 7：618-630, 2010 15）Matsuura K, et al：Biochem Biophys Res Commun, 425： 321-327, 2012 16）Otsuji TG, et al：Stem Cell Reports, 2：734-745, 2014 17）Morizane A, et al：J Neurosci Res, 89：117-126, 2011 B o o k エンス）．学術振興会特別研究員（PD）．奈良先端科学技術大学院大学遺伝子教育研究センター，京都大学再生医科学研究所再生誘導研究分野を経て，’09 年より京都大学物質 - 細胞統合システム拠点 iPS 細胞研究センター特任講師．’10 年より京都大学 iPS 細胞研究所講師． I n f o r m a t i o n 骨ペディア売中好評発骨疾患・骨代謝キーワード事典編集／日本骨代謝学会 ●骨粗鬆症，関節リウマチ，歯周病，がんの骨転移など，幅広い疾患群を含む骨疾患．これらを基礎も臨床もまるごと理解！ ●収録用語は100以上！骨代謝を司る重要な因子や，疾患，治療・診断を網羅し，イラスト入りで明解に解説．第一人者の先生にご解説いただいた決定版です．実験医学　Vol. 33　No. 18（11 月号）2015 ISBN978-4-7581-2056-2 発行分子，細胞から疾患まで骨研究のすべてが髄までわかる！定価（本体 6,800 円＋税）２色刷り B5 判 328 頁 2963 製製品品特特集集再生医療へつながる幹細胞培養の最新テクノロジー協賛企業記事再生医療を支える臨床グレードの細胞培養用基質およびタンパク質分解酵素の開発株式会社ニッピ　プロテインエンジニアリング室山本卓司株式会社ニッピでは，コラーゲンを中心とする細胞外マトリクスの生物学上の機能や，それらの抽出物の物性や機能について研究を行ってきており，これらの研究成果をもとに細胞培養に応用できる製品の製造販売を行ってきた．近年の再生医療分野の進展にともない，われわれは再生医療分野で利用できる臨床グレードの製品づくりに注力をしてきた．ここでは，われわれが開発してきた臨床グレードの試薬である，1）ゼラチン，2）ラミニンおよび 3）コラゲナーゼについて紹介したい． 1）ゼラチンゼラチンは，動物の皮や骨に含まれるコラーゲンを熱抽出，あるいは加水分解や酵素分解することによって得られるコラーゲン分解物である．原料としては，ウシやブタの皮や骨がよく利用されているが，最近では魚の皮やウロコなどから抽出したゼラチンも利用さ（図）．これらの成形物は，骨の再生，結合組織の再生や表皮の再生など，埋め込む組織に合わせて選択を行うことが可能である． 2）ラミニンラミニンタンパク質は，上皮・内皮組織や脂肪細れている．医療用途としては古くから経口カプセル，胞・筋細胞と結合組織の境界を形成する基底膜の主要貼付剤などに用いられてきたが，その高い生体親和性な構成タンパク質であり， α， βおよびγ鎖のサブユニッと生分解性により近年では，DDS 基材や scaffold などとして生体内への埋植用途にも使用されている．われわれはこれら生体内投与の際に問題となる発熱性物質（エンドトキシン）を低減させた低エンドトキシンゼラチン「メディゼラチン」を開発し，生体への埋植をターゲットとした応用開発を進めている．エンドトキシンは生体内投与を行う医薬品，医療機器では必ず規格値が設定されるが，ゼラチンの場合，動物組織を原料として製造されるため，相当量のエンドトキシンが含まれることが常であった．われわれがゼラチンフィルムメディゼラチン開発したメディゼラチンの場合 10 EU/g 以下を規格値として設定しているため，医療機器の材料として利用する際においてもエンドトキシンの規格値のコントロールが可能である．ゼラチンを医療用材料として考えたときのメリットは成形の自由度であり，スポンジ，シートおよびフィルムなどさまざまな形状で成形することが可能である 2964 ゼラチンスポンジゼラチンブロック図　ゼラチン＜協賛企業記事＞　株式会社ニッピ写真 1　iMatrix-511MG 写真 2　ブライターゼ C トから構成されており，さまざまな生物学的機能を発由来原料基準への適合性について「異論はない」との揮することが知られている． α， βおよびγ鎖の組合わ判断をいただき， 2015 年 6 月から販売を開始した．せによってアイソフォームが異なり，各ラミニンは細 iMatrix-511MG は，臨床応用を行うための幹細胞を in 胞表面のインテグリンなどのレセプターや他の細胞外 vitro で培養するための基質として使用されており，臨マトリクス成分，ヘパリンなどと特異的に結合する．床研究での使用が広がってきている．このラミニンタンパク質は，全長が約 400 〜 800 kD これらのラミニンの技術開発の成果が認められ，関もある巨大分子であり，近年の遺伝子工学の技術を用口清俊（大阪大学），中川誠人（京都大学）および服部いても，組換えタンパク質の作製が容易ではない．大俊治（ニッピ）は，第 13 回（平成 27 年度）産学官連携阪大学の関口清俊らは，このラミニンタンパク質のう功労者表彰の文部科学大臣賞を受賞した．ちの，インテグリンと結合する部位を含む短い断片を作製して細胞培養基質として応用することを考案した． 3）コラゲナーゼこの断片化したラミニンタンパク質は，ラミニン -E8 細胞を用いた再生医療を行う場合には，いったん生断片とよばれ，全長のラミニンタンパク質と変わらな体外へとり出した細胞を in vitro で培養し患者の体内いインテグリンとの接着活性をもつことがわかっていに戻すというプロセスがとられる．自家移植においてる．α5，β1 およびγ1 鎖で構成されるラミニン 511 も他家移植においても，ドナーの組織から細胞をとりタンパク質の E8 断片（ラミニン 511-E8 断片）は，内出す際には，組織を分解する必要がある．コラゲナー皮細胞や幹細胞などの細胞表面に存在するインテグリゼは，コラーゲンを特異的に分解するタンパク質分解ンα6β1と結合することが知られており，ES/iPS 細胞酵素であり，再生医療において組織から細胞を分離すの培養時には，フィーダー細胞の代替培養基質としてるために，他の酵素と組み合わせた上で使用されてい使用することが可能である．さらに，ラミニン 511-E8 る．われわれが臨床グレードのコラゲナーゼを開発す断片を使用した場合には，ROCK 阻害剤（Y27632）をるきっかけとなった，Ⅰ型糖尿病の治療法である膵島使用せずに幹細胞様の性質を維持することができ，か移植手術においても，ドナーの膵臓から膵島を分離すつシングルセルでの継代が可能である．ラミニン 511-E8 る際にコラゲナーゼを使用している．現在，試験研究断片を製品化した「i M a t r i x - 511」は，現在，広く用途として広く使用されている細胞分散用コラゲナーフィーダーフリー培養用基質として使用されている．ゼは，Clostridium histolyticum 産生コラゲナーゼを精 iM a t r i x - 511 の臨床グレードである「i M a t r i x - 製した酵素製剤がほとんどであるが，精製度は高くな 511MG」は，2014 年 12 月に PMDA（独立行政法人医い場合が多く，コラゲナーゼ以外の酵素が含まれてい薬品医療機器総合機構）との対面助言において，生物る場合が多い．また，C. histolyticum 産生コラゲナー 2965 製品特集剤が広く使用されているが，各酵素の混合比は固定されており，このことが個別化再生医療実現の壁となっていることが指摘されている．われわれが開発した臨床グレードのブライターゼ C は，他の酵素と自由に組合わせて使用することができ，目的に合わせた最適な酵素条件をカスタマイズすることが可能となり，再生医療のさまざまな場面において活用されるものと考えている．写真 3　研究所外観まとめ以上のように，われわれが研究開発してきた各種臨床グレード試薬は，再生医療において使用する細胞をゼには，ColG と ColH の 2 種類のアイソフォームがあ「分離」し，「培養」し，体内に「埋植」するための試薬り，それぞれの分解対象となる基質が異なることが報として，広く活用されている．これからも，われわれ告されている．また，その混合比により活性が変わるの強みである細胞外マトリクスに関する研究を活用し可能性があり，細胞分散効率に大きな影響を与えるとたさまざまな技術開発を行い，再生医療を支援する製いう報告もある．われわれが開発したコラゲナーゼで品づくりを行っていきたいと考えている．ある「ブライターゼ C」は，アイソフォームが 1 種類である G r i m o n t i a h o l l i s a e のコラゲナーゼ遺伝子を， Brevibacillus 発現系に組換えることによって，高純度のリコンビナントコラゲナーゼとして作製される． 1 種類のリコンビナントコラゲナーゼを用いることにより，活性が安定な酵素製剤となり，臨床での使用における信頼度が高まると考えられている．コラゲナーゼが分解する基質は，コラーゲン様配列をもったタンパク質のみであり，細胞分散に使用する際には，他のタンパク質分解酵素を最適な濃度で混合して使用する必要がある．膵島移植手術における膵島分離では，コラゲナーゼとサーモリシンの混合酵素製 2966 株式会社ニッピプロテインエンジニアリング室東京都足立区千住緑町 1-1-1 TEL：03-3888-5184　FAX：03-3888-5136 http://www.nippi-inc.co.jp/