サンプル調製法 血清・血漿サンプル ＜サンプル調製・基本プロトコール＞ ①サンプルを PBS または変性バッファーで 10 倍に希釈する。 （変性バッファーを使用した場合は 4℃で 10 分間攪拌する） ②希釈したサンプルをさらに Binding/Washing Buffer で 10 倍に希釈する。 ③10,000rpm, 4℃で 5 分間遠心し、上清を使用する。 ポイント 手順①で使用する希釈バッファーによりアッセイ条件（非変性-変性）を選択し、手順②の希 釈でサンプルを Binding 条件に調製します。 血清サンプルは 50∼200 倍を目安に希釈して Chip にアプライするのが基本プロトコールで す。 ＜サンプル採取時の注意点＞ 調製方法を統一する ※ 血清：凝固時間や遠心条件 ※ 血漿：採血方法（heparin, sodiumcitrate, EDTA など） 赤血球を遠心で除く 溶血を避ける サンプルは分注して保存し、凍結融解はなるべく繰り返さない（比較するサンプルは凍結融 解の回数を揃える） 凝固系因子解析などを行う場合以外は血清サンプルでの実験を推奨する ＜サンプル調製時に考慮すべき点＞ 未分画 VS. 前分画（等電点、サイズなど） ※ 分画することにより検出されるピークがある 未変性 VS. 変性 ※ 変性条件下では未変性条件下と異なるプロファイルが得られる場合がある アルブミン、脂質などの除去 ※ アルブミン、脂質の除去によって検出されるピークがあるが、一方検出されなくなるピーク もあるので注意する Chip への添加濃度（一般的には希釈率を揃えてアッセイする） ※血清は 50∼200 倍を目安に希釈する 組織・細胞サンプル ＜サンプル調製・基本プロトコール＞ ①組織および細胞サンプルをホモジナイズし、遠心したのちに上清を回収する。 ②回収した抽出液サンプルを Binding/Washing Buffer で 0.1∼1.0mg/mL を目安に希釈する。 ③10,000rpm, 4℃で 5 分間遠心し、上清を使用する。 ポイント 抽出液サンプルは予めタンパク濃度の定量を行うことをお勧めします。 0.1∼1.0mg/mL はあくまでも目安です。サンプルに合わせ実験に適したタンパク濃度を検討 してください。 ＜サンプル採取時の注意点＞ 組織サンプルについて ※ ホモジナイズ前に良く洗い、血液の混入を避ける ※ 組織の摘出および調製は低温・短時間で操作する ※ ホモジナイズ条件を一定にする（バッファーボリューム、ストローク数など） LCM サンプル ※ プロテインチップシステムによる解析において必要な細胞数 ∼10,000 cells/spot (average) ∼2,000 cells/spots (minimum) 培養細胞 ※ 細胞調製時に PBS などで洗浄することにより FCS の混入を避ける ※ 細胞数に対するバッファー量、プロトコール（ソニケーションの強度、時間など）を一定に する FACS サンプル ※ 固定する場合は固定方法・時間を一定にする 抽出条件・方法は必ず一定にする ※ サンプル間、Lot 間のばらつきをなるべく抑える サンプルは分注して保存し、凍結融解はなるべく繰り返さない（比較するサンプルは凍結融 解の回数を揃える） ＜サンプル調製時に考慮すべき点＞ 未分画 VS. 前分画 ※ 分画することにより検出されるピークがある ※ 分画方法例①：Whole Lysate を等電点、サイズ、アフィニティカラムなどで分画 ※ 分画方法例②：細胞を予め細胞質、核、ミトコンドリア、膜画分に分画してから調製 抽出バッファーの組成 lipid の除去（組織） Chip への添加濃度（一般的にはタンパク濃度を揃えてアッセイする） 尿サンプル ＜サンプル調製・基本プロトコール＞ ①サンプルを PBS または変性バッファーで 2 倍に希釈する。 （変性バッファーを使用した場合は 4℃で 10 分間攪拌する） ②希釈したサンプルをさらに Binding/Washing Buffer で 5 倍に希釈する。 ③10,000rpm, 4℃で 5 分間遠心し、上清を使用する。 ポイント 手順①で使用する希釈バッファーによりアッセイ条件（非変性-変性）を選択し、手順②の希 釈でサンプルを Binding 条件に調製します。 尿サンプルは 5∼10 倍を目安に希釈して Chip にアプライしてください。 ＜サンプル採取時の注意点＞ 尿サンプルはタンパク濃度、塩濃度の日内変動が非常に大きなサンプルなのでその影響を 少なくするには 24 時間蓄尿を用いると良い ※ 必要に応じて 4℃保存、プロテアーゼインヒビターの添加等を行う 混入細胞は遠心で除く 溶血を避ける サンプルは分注して保存し、凍結融解はなるべく繰り返さない（比較するサンプルは凍結融 解の回数を揃える） ※ 尿サンプルはタンパク濃度が低く、凍結融解の影響を受けやすいので特に注意が必要 ※ 採取したサンプルを遠心し、変性バッファーを加えてから分注保存すると良い ＜サンプル調製時に考慮すべき点＞ 未変性 VS. 変性 ※ 変性条件下では未変性条件下と異なるプロファイルが得られる場合がある 濃縮・脱塩の必要性 ※ 濃縮してタンパク濃度を上げると検出されるピークがある ※ 塩濃度が高いと Chip へのタンパク吸着を阻害する場合がある サイズ分画（低分子の場合） ※ 高分子側を除くことで検出される低分子側のピークがある Chip への添加濃度（希釈率またはタンパク濃度を揃えてアッセイする） CSF サンプル ①サンプルを PBS または変性バッファーで 2 倍に希釈する。 （変性バッファーを使用した場合は 4℃で 10 分間攪拌する） ②希釈したサンプルをさらに Binding/Washing Buffer で 5 倍に希釈する。 ③10,000rpm, 4℃で 5 分間遠心し、上清を使用する。 ポイント 手順①で使用する希釈バッファーによりアッセイ条件（非変性-変性）を選択し、手順②の希 釈でサンプルを Binding 条件に調製します。 CSF サンプルは 5∼10 倍を目安に希釈して Chip にアプライしてください。 ＜サンプル採取時の注意点＞ 血液の混入を避ける 溶血を避ける サンプルは分注して保存し、凍結融解をなるべく繰り返さない（サンプルは氷上で融解させ る） ※ CSF サンプルはタンパク濃度が低く、凍結融解の影響を受けやすいので特に注意が必 要 ＜サンプル調製時に考慮すべき点＞ 未分画 VS. 前分画（等電点、サイズなど） ※ 分画することにより検出されるピークがある 未変性 VS. 変性 ※ 変性条件下では未変性条件下と異なるプロファイルが得られる場合がある アルブミン、脂質などの除去 ※ アルブミン、脂質の除去によって検出されるピークがあるが、一方検出されなくなるピーク もあるので注意する Chip への添加濃度（一般的には希釈率を揃えてアッセイする） 培養上清サンプル サンプルを Binding/Washing Buffer で 3∼5 倍に希釈して使用する。 ポイント 希釈倍率 3∼5 倍はあくまでも目安です。サンプルに合わせ実験に適した希釈倍率を検討し てください。 必要であれば濃縮・脱塩等の操作を行ってください。 ＜サンプル採取時の注意点＞ 通常、無血清培地を用いる 血清培地から無血清培地に変換する場合はできるだけアルブミンの混入を避ける サンプルは分注して保存し、凍結融解をなるべく繰り返さない ＜サンプル調製時に考慮すべき点＞ 未変性 VS. 変性 ※ 変性条件下では未変性条件下と異なるプロファイルが得られる場合がある 濃縮・脱塩の必要性 ※ 濃縮してタンパク濃度を上げると検出されるピークがある ※ 塩濃度が高いと Chip へのタンパク吸着を阻害する場合がある サイズ分画（低分子の場合） ※ 高分子側を除くことで検出される低分子側のピークがある Chip への添加濃度（希釈率またはタンパク濃度を揃えてアッセイする） 変性バッファー組成例 ¾ 9M Urea/2% CHAPS/50mM Tris-HCl, pH9 ¾ 7M Urea/2M Thiourea/4% CHAPS/1% DTT/2% ampholites (注：DTT を含むため、IMAC での使用は避ける)
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