4-2. “粘膜免疫の重要性（Ｍｇワクチンを例として）” メルボルン大学教授 Dr. Kevin Whithear 獣医学博士講演粘膜免疫の重要性（Ｍｇワクチンを例として）メルボルン大学教授 Dr. Kevin Whithear 獣医学博士ご紹介ありがとうございました。何回か日本に来ていますが、春、桜の季節に来るのは初めてですが、絵葉書で見るより美しい景色に感激しています。 The Importance of Mucosal Immunity 粘膜免疫の重要性 MG Vaccines as a Case Study MG生ワクチンを例にして Kevin Whithear BVSc PhD School of Veterinary Science The University of Melbourne Australia 今日のテーマは、「ニワトリにおける粘膜免疫の重要性」で、Ｍｇ生ワクチンを例にしてお話したいと思います。粘膜免疫  粘膜面に感染する以下のような病原体で非常に重要  サルモネラ  マイコプラズマ 2 粘膜免疫とはどういうものかといいますと、粘膜表面の表面上皮細胞に起こる免疫応答で、これには呼吸器と消化管等で見られるものです。粘膜免疫は、粘膜表面に感染する病原体で非常に重要です。消化管ではＳＥのようなサルモネラや、呼吸器では、Ｍｇのようなマイコプラズマ等があります。ただこれらの病原体の自然感染が起こる場合のメカニズムはただ単に粘膜免疫が関与するだけでなくもっと複雑です。ワクチン免疫は粘膜上にあるこれらの病原体をターゲットとするのが理想的です。そうする事によりそれらの病原体が傷害を起こすことを効果的に防ぐことができます。これからマイコプラズマ生ワクチンを例にとって、この粘膜免疫の重要性をお話ししたいと思います。 MG 感染とは正常な気管気管粘膜粘膜下織気管軟骨正常な気管の断面 3 まずＭｇと粘膜免疫について説明する前に、Ｍｇがどのように病気を起こすかということを簡単にご説明したいと思います。Ｍｇ感染のメカニズムを理解するには、ニワトリの呼吸器の構造を知っておかなくてはなりません。ニワトリの呼吸器は副鼻腔、口腔、気管それから気管支からなります。これが正常な気管の組織像ですが、一番下に気管軟骨、その上に粘膜下織、それから気管粘膜が一番内側にあります。今日お話しする粘膜免疫の中で一番重要な役割を果たすのがこの気管粘膜で、この表面は絨毛を持った細胞と、粘液分泌腺からなっています。Ｍｇ感染が起こった場合、気管はどのように変化をするのでしょうか。この矢印がＭｇの通常の感染ルートを示しています。多くの場合は近くのＭｇに感染しているニワトリからの感染ですが、まれに非常に離れたところから空気感染するようなこともあるようです。Ｍｇの感染が起こると、このピンクで示した呼吸気道で増殖を始めます。 MG 感染とは呼吸器道への感染 MGが気管粘膜に接着 MGが気管粘膜に接着 4 これは先ほどの写真よりもかなり倍率の高い電子顕微鏡の写真です。マイコプラズマが気管の粘膜上の絨毛に接着しているのが見えると思います。マイコプラズムは気管粘膜上皮に感染する病原体です。まず気管粘膜上皮に感染して障害を起こします。私たちが考えている良いワクチンというのは、気管局所に働いて局所免疫を発揮させるようなワクチンです。ですからワクチン接種により惹起された免疫で、その後に野外株の感染が起こったときに十分な防御効果を発揮させることができます。もう一つ重要なことは、野外の強毒Ｍｇが鶏群に感染した場合、それが持続感染を起こして、かなり長い間、鶏群の中に残っているということがあります。このような持続感染が起こっている場合には、感染しているニワトリはキャリアとなって他の感染していない感受性のあるニワトリに感染を起こす原因になります。これがＭｇをコントロールする上で非常に大きな問題となります。ですから、生ワクチンを開発するにあたって非常に重視したポイントは、ニワトリに持続感染する弱毒生ワクチン株の確立です。ワクチン株が持続感染するということは、継続的に免疫刺激を与えてニワトリを長期間Ｍｇ感染から防御してくれると考えられます。 Mycoplasma 感染とは強毒 MG 株感染後の気管の病変強毒MG 感染による粘膜の肥厚強毒MG感染による粘膜の肥厚 5 次に、強毒Ｍｇが感染した場合、気管はどの様な変化を起こすかを簡単にご説明いたします。先ほど正常な気管像をお見せしましたが、これが強毒Ｍｇ感染後の気管粘膜像です。このように非常に肥厚します。この肥厚は主にリンパ系細胞や炎症細胞等が集まることによって起こります。また、気管の表面にある絨毛が消失し、気管内に炎症産物が認められます。Ｍｇの病原性を気管粘膜の厚さで評価するという方法をいま使っております。この方法は日生研の布谷先生らによって報告されたもので、ワクチンの有効性を評価するのにも有用です。というのは、ワクチンが有効であれば攻撃に対して防御し、粘膜の肥厚が見られないからです。 MG ワクチン選択肢は?   不活化ワクチン生ワクチン  F株  弱毒株  Mg生ワクチン（ＮＢＩ）（ ts-11 ）  6/85 6 これからＭＧワクチンのお話になりますが、まず現在どのようなＭｇワクチンが市販されていて、どのような選択肢があるのでしょうか。基本的には２つのタイプのワクチン、即ち不活化ワクチンと生ワクチンです。不活化ワクチンの有効性については、「いい」という報告もあれば「悪い」という報告もあり、その評価は様々です。たぶんその理由としては、アジュバント、特にオイルアジュバントの効果の違いによるものではないかと思います。その点、生ワクチンは、有効性であるとの報告が多数あります。生ワクチンにも２種類あり、一つはＦ株のように若干病原性が残っている株と弱毒されたほとんど病原性がない株です。Ｆ株というのは、粘膜免疫を惹起するのに非常に有効な株ですが、ただ中程度の病原性を残しております。現在アメリカ等では使われておりますが、これは病原性が残っていますので選択としてはお勧めすることはできません。現在市販されている弱毒株は２種類あります。一つは、我々が開発したＭｇ生ワクチン（ＮＢＩ）で株名としてはｔｓ-11 株です。もう一つは、インターベット社の６/85 株です。これからは、主にこの弱毒株についてお話します。ただ報告されている文献等では、 Mg 生ワクチン（ＮＢＩ）のｔｓ-11 株に関するものは比較的多いのですが 6/85 株についてはほとんどありませんので、お話の中心はｔｓ-11 株、すなわちＭｇ生ワクチン（ＮＢＩ）についてです。 MG ワクチンに何を期待するのか?     安全性気道での強固な局所免疫の付与  気道粘膜面での抗原刺激免疫の長期持続  気道粘膜面での持続的抗原刺激生産性の改善 7 Ｍｇワクチンの開発に当たりＭｇを使用する立場の方々がどういうことをＭｇワクチンに期待するのかを考えました。まずワクチン株に病原性がなく安全でなくてはなりません。２つ目は、接種したワクチンが効果を発揮するためには、気道で強固な局所免疫を付与しなくてはなりません。そのためには、接種したワクチン株が気管粘膜上に定着・増殖し、そこで持続的な抗原刺激を与え続けなくてはなりません。ワクチンを気管粘膜上に接種する方法としては、ニワトリの分野では通常スプレーと点眼の２つの方法があります。６/85 株もしくはＭｇ生ワクチン（ＮＢＩ）、どちらも効果は接種量に依存します。ですから、効果を発揮するための必要最小限の量以上を接種する必要があります。そのためＭｇ生ワクチン（ＮＢＩ）では、点眼を接種方法として採用しました。点眼は非常に手間はかかりますが１羽１羽接種するので必要な量を均一に接種するのに適しています。スプレーは非常に簡便な方法ですが、ただすべての鶏が均一に、最小有効量以上のワクチン菌株を投与することができるかは非常に疑問です。３つ目として、このワクチンは種鶏や採卵鶏に使用されるので、免疫が長期間持続しなければなりません。ですからこのためには、気道粘膜表面で持続的な抗原刺激を与えなければなりません。そしてワクチンを使う最終的な目的は、ワクチン接種により生産性を改善させるということで、これが非常に重要になります。これから、これらの点についていくつかデータをお示ししながらもう少しお話しいたします。弱毒Mg生ワクチンの安全性 Mg 生ﾜｸﾁﾝ(NBI) 6/85 弱い弱い感染性弱い* 非常に弱い* 産卵に対する影響ない** ? 卵質に与える影響ない** ? 他のウイルスワクチンとの併用可不可要因病原性 *Ley et al (1997) Avian Diseases 41:187-194 **Branton et al (2000) Avian Diseases 44:618-623 8 このスライドは弱毒Ｍｇ生ワクチンの安全性に関して既に学会等で発表されているデータをまとめたものです。病原性については、両株とも弱毒された株ですので、病原性は非常に弱く、安全なワクチンです。次に感染性についてです。接種したワクチン株が他の感受性鶏に感染を起こさないという点です。感染性については、ノースカロライナ州立大学のレイ博士によって「アビアンディジーズ」で報告されています。Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）は、非常に同居感染性は弱く、ケージでしきられ直接接触がない場合には場合には感染はしませんが、同じケージ内では感染することもあります。６/85 株の感染性は非常に弱いと分類され、同じケージに入っていてもほとんど感染は起こりません。ですからこの同居感染性が非常に弱いということは、接種したワクチン株が IBD のように広がっていくことは期待できませんから、１羽１羽確実に免疫をする必要があります。ですから 6/85 株をスプレーという接種方法が適切な方法であるかは非常に疑問です。また、接種したワクチン株により産卵率や卵質に対し悪影響を与えないという点も非常に重要です。ブラントンらの最近の報告によれば、Ｍｇフリーの鶏群にＭｇ生ワクチン(ＮＢＩ)を接種した例では、産卵率や卵質に全く悪影響を及ぼさなかったということです。私が知る限り、6/85 株ではそういう研究がまったくなされていません。もう一つの安全性の目安として、他のウィルスワクチンと併用ができるかというのも一つの指標になります。Ｍｇと弱毒ウィルスワクチン株が同時に感染することにより病原性が増強するということはよく知られています。Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）では、種々の弱毒ウィルス生ワクチンと同時に接種しても、まったく問題がないことを確認してあります。それに対して、インターベットの使用説明書にもありますが、6/85 株を接種した場合、その前後２週間は、他の弱毒ウィルス生ワクチンを使用してはならないことが明記してあります。粘膜への免疫刺激ワクチン株の気管での持続感染* Ｍｇ (% ) 80 離 40 分 100 20 生ﾜｸﾁﾝ（ 6/85 t 60 一生涯持続 0 1 3 ワク 6 9 チン 12 15 ` *Ley et al (1997) Avian Diseases 41:187-194 9 続いて粘膜への免疫刺激についてお話ししたいと思います。このスライドでお示ししているのは、ワクチン接種後かなりの長期間にわたってワクチン株が気管で定着しているということです。この仕事もレイ博士によって行われたもので、この黄色い線がＭｇ生ワクチンを点眼で接種した群で、６/85 株接種群は青い線で示しています。この試験では、ワクチン接種後、１週から 15 週まで定期的に気管を採材して、そこからＭｇの分離を行なっております。Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）を接種した群では、分離時期によって若干異なりますが 60％から 90％ぐらいのニワトリからワクチン株が分離されております。それに対して６/85 株では、最大に分離されても 20％の鶏からしかワクチン株は分離されていません。ですからこのデータから言えることは、6/85 株は、Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）の ts-11 株よりも、その気管粘膜への感染率というか定着率が圧倒的に低いということです。また、私が行った試験では、Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）を点眼で接種した群からは、67 週齢時になっても気管よりワクチン株が分離されていますので、ワクチンの効果は一生涯持続するというふうに私は考えています。気道における強固な局所免疫 Mg生ワクチン（NBI）と不活化ワクチンの比較群 Mg 生ﾜｸﾁﾝ（ NBI）（ ts-11）* n 凝集スコア粘膜の厚さ 10 1.8±1.1 b 不活化ワクチン * 10 3.7±0.5 c 無接種対照* 10 0 c 無攻撃対照 10 0 a 5.7-倍 5.7-倍 a,b,c *ワクチン接種後4週で噴霧攻撃 1.6-倍 1.0-倍 P<0.05 10 次に気道局所に強い局所免疫を確立できるかについて考えてみたいと思います。生ワクチンと不活化ワクチンの比較です。というのは６/85 株ではこのようなデータが得られていませんので、ここでは Mｇ生ワクチン（ＮＢＩ）と不活化ワクチンを例にとって、気道における局所免疫の強さについてご説明したいと思います。左の列は試験群で、この☆印（星印）がついているのは、ワクチンを接種してから４週で噴霧攻撃をしたという意味です。ですから第 1 群は、Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）を接種後、攻撃した群、２群は不活化ワクチンを接種後、攻撃した群、そして３群は、ワクチン無接種で、攻撃を行った群です。最後の群はワクチン無接種で、攻撃もしていない無接種･無攻撃対照群です。ここで、2 列目は試験に使用した１群の羽数で、各群 10 羽を使用しております。3 列目は、平板凝集反応の強さをスコア化したもので、スコアは、０から４＋まで、凝集の強さで分類しています。０の場合はまったく凝集が認められないもの、すなわち陰性です。１＋は非常に弱い凝集、４＋は非常に強い凝集というふうに表しています。この凝集スコアは、ワクチンを接種してから４週後の攻撃前に測定したものです。ですからそれぞれのワクチンによる抗体応答を測定したものです。Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）接種群のスコアは 1.8 で、中程度の強さの凝集を示しています。それに対して不活化ワクチン接種群では 3.7 ですから、最も強い凝集スコアの４に近い非常に強い凝集抗体反応を示しております。ですから凝集抗体のみを見れば、不活化ワクチンは生ワクチンより非常に良い抗体応答を示しています。最後の列に粘膜の厚さとありますが、これは攻撃後の粘膜肥厚の程度を示したものです。ここでは、ワクチン無接種・無攻撃群の粘膜の厚さを基準とし、その厚さを１としました。Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）接種群では 1.6 倍と無接種･無攻撃対照群に比べて若干の肥厚はしております。それに対して不活化ワクチン接種群では 5.7 倍です。これはワクチン無接種で攻撃した群とまったく同じですから、この試験では、不活化ワクチンはまったく局所免疫、つまり粘膜免疫を惹起していないということがわかります。気道における強固な局所免疫コマーシャル種鶏 Mg生ワクチン（ NBI））接種　3 週齢 Mg生ワクチン（NBI 接種　3週齢 — 攻撃17 攻撃17週齢 Mg生ワクチン（ NBI）） Mg生ワクチン（ Mg生ワクチン（NBI Mg生ワクチン（ NBI） NBI）接種・無攻撃接種・攻撃ワクチン無接種攻撃 11 いまの試験はＳＰＦ鶏で行なった試験ですが、これは一般の種鶏農場で行なった試験です。ワクチンは３週齢時に接種しています。ワクチンの接種も自分たちがやったものではなくて、その農場の方に任せて接種をしてもらいました。17 週齢時、つまりワクチンを接種してから 14 週後に農場から実験室へ移動して攻撃をしました。左の写真がワクチンのみを接種した群です。前にお見せした正常気管像とほぼ同じであることがお分かりになると思います。Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）接種によって粘膜の肥厚がまったく見られない、つまり安全なワクチンであることがわかります。中央の写真は、Ｍｇ生ワクチン接種群に噴霧攻撃し、攻撃後２週間の気管の組織像です。この２つを見比べていだきますとわかると思いますが、この２つの気管粘膜の厚さはまったく変わりませんし、この気管の粘膜面に炎症像というのがまったく見られません。右側がワクチンを接種しないで攻撃した群の気管像です。粘膜の厚さが攻撃によって肥厚しています。免疫の長期持続ワクチン接種後40週で攻撃* 群 n 凝集スコア粘膜の厚さ Mg 生ワクチン(NBI)* 13 1.3±1.0 a ワクチン無接種･攻撃* 10 0 b 4.7-倍ワクチン無接種･無攻撃 9 0 a 1.0-倍 a,b *ワクチン接種後40週にエアゾール攻撃 1.4-倍 P<0.05 12 前にご説明いたしましたように、Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）による免疫は非常に長期間持続すると言いましたが、これはワクチンを接種してから 40 週でそれを確認した試験です。上の２群には、ワクチン接種後 40 週目に攻撃しています。1 番下の群には攻撃を行っていません。つまり対照群です。ワクチン接種後 40 週でも平均の凝集スコアが 1.3 と、まだ抗体応答が認められております。6/85 株とＭｇ生ワクチン（ＮＢＩ）との違いというのはもう一つあります。それは抗体応答ですが、6/85 株では、ワクチン接種後の抗体応答が見られません。ここでもワクチンを無接種で無攻撃群の気管粘膜の厚さを１として表しています。ワクチン接種群は 1.4 倍ですが、これは統計学的に処理してもまったく有意差が認められません。それに対してワクチン無接種で攻撃をした群では、５倍近い厚さになっており、無接種無攻撃対照群、もしくはワクチン接種・攻撃群に比べて、統計学的有意差が認められます。産卵の改善コマーシャルレイヤー – 日本* ワクチン 76 週での HH 産卵数 MG 不活化ワクチン 315.3 Mg 生ワクチン（ NBI） (ts-11) 338.4 *日本バイロジカルズ資料 13 皆さんが最も興味をもっていることは、Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）がどの程度産卵成績を改善することができるのかだと思います。これは日本での野外成績ですが、ワクチン接種による産卵率の改善の一例です。これは過去 5 年間にわたる 44 万羽のニワトリで行われた試験のまとめです。この試験では、Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）は 54 日、不活化ワクチンは 80 日で接種をされています。この試験の結果、76 週令までのヘンハウスの産卵個数を見ますと、23 個の差がＭｇ生ワクチン（ＮＢＩ）と不活化ワクチンの群では見られております。ですから非常にこの違いというのが明らかになっています。ですからこれは非常に大きな違いです。これはケージで飼っているニワトリの例ですが、平飼で飼っている場合でも同じような違いがみられます。Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）はオーストラリアではほとんどのブロイラー種鶏にも使われております。ﾌﾞﾛｲﾗｰの生産成績改善コマーシャルブロイラー種鶏にワクチン接種- レバノン* 種鶏での接種ワクチン Mg 生ﾜｸﾁﾝ(NBI) 無接種種卵からのブロイラーの MG 分離成績 FCR 斃死率陽性率 0 2.05 5.3% 42% 2.44 10.7% *Barbour et al (2000) Poultry Science 79:1730-1735 14 これはバーボーラによって最近報告されたレバノンの例です。ブロイラー種鶏にワクチンを接種した場合、コマーシャルブロイラーの生産成績が改善されたという報告です。これはＭｇの問題がある種鶏群６群で行いました。その６群のうち３群をＭｇ生ワクチン（ＮＢＩ）接種群、そして残りの３群を無接種対象群として行ないました。 2 列目の種卵からの分離成績は、Ｍｇの垂直感染の有無を種卵からマイコプラズマを分離することにより検討したものです。Ｍｇ生ワクチン（ＮＢＩ）接種群ではまったくＭｇが分離されません。それに対してＭｇ生ワクチン（ＮＢＩ）を接種していない群では、42％の種卵からＭｇが分離されています。このＭｇの垂直感染率の違いがコマーシャルブロイラーの成績にも反映されていて、飼料要求率では、0.4 程度の改善が認められています。また斃死率も約半分に減っており、全体としても生産成績が大きく改善されています。結論粘膜表面での抗原刺激は Mg感染に対する防御免疫産生に重要である  生ワクチンは不活化ワクチンより優れている  Mgワクチン株の持続感染は長期（終生）免疫を付与するために重要であろう  15 まとめになりますが、今までの話の中で皆さんに粘膜免疫の重陽性と、粘膜免疫を与える上での生ワクチンの役割について説明してきました。粘膜表面の抗原刺激というのは、Ｍｇ感染に対する防御免疫産生に重要であり、その目的では生ワクチン（ＮＢＩ）の方が不活化ワクチンより優れています。また種鶏や採卵鶏にＭｇ生ワクチンを接種するもうひとつの目的としては、ワクチンを 1 回接種することにより、その鶏群を、終生Ｍｇの感染から防御するということも重要です。そのためには、ワクチン株が終生にわたって持続感染して、継続的に抗原刺激を与えていくことが必要です。最後に、このワクチンに関する研究は既に 15 年以上にわたってやっています。しかし、この研究もこれらの機関や研究者の協力なしには今日の成果はないのではないかと思います。この場を借りて感謝の気持ちを述べさせていただきます。最後にこのような機会を与えてくださった主催者の方々に心より感謝いたします。どうもありがとうございました。以上