研究班紹介 ● A02 原生生物・寄生細菌間の DNA 分子フローの可視化と高精度定量 研究代表者：見坂武彦（大阪大谷大学薬学部・講師） http://www3.osaka-ohtani.ac.jp/ph/11/ ●公募研究の概要 クロファージ内で増殖し危害を及ぼすことが知られてお ゲノム解析の進展に伴い、遺伝子伝播は多様な細菌の り、アメーバでの増殖能は、細胞寄生性病原細菌の指標 新規形質の獲得、環境適応、進化に重要な役割を果たし とされている。 ていることが明らかとなってきた。細菌はファージや原 本研究ではアメーバとその寄生細菌をモデルとして、 核生物だけではなく、捕食者や宿主などの真核生物との 以下の内容を検討する。 間でも遺伝子伝播を行っている。すなわち、栄養のみな ① DNA 分子を取り込んだ細菌をシングルセルレベルで らず遺伝子という観点から相互に密接な関係を有してい る（図 A） 。アメーバ寄生細菌は、細菌同士だけでなく アメーバとの間でも遺伝子伝播を行った痕跡があり、寄 生関係の進化の過程においても、宿主と寄生体間の遺伝 可視化する技術を最適化する。 ②アメーバと細胞寄生細菌との間の遺伝子伝播実験に必 要な供与体を作製する。 ③マイクロコズムにおいて、アメーバと環境中の寄生細 子の伝播とその多様化が重要な役割を果たしていること 菌との間の DNA フローを新手法で可視化・定量し、 が認識されつつある。 既存の方法（培養やレポーター発現）を含めて総合的 我々の研究グループは、これまで細菌と溶存態 DNA やファージとの間の遺伝子の流れを高精度に捉えるため に遺伝子伝播を解析する。 我々の開発した細胞内遺伝子増幅法は、遺伝子伝播の に、細胞内で特定遺伝子を増幅し蛍光顕微鏡下で可視化 第一段階である細胞内への DNA の移行を捉えることが する細胞内遺伝子増幅法を独自に開発・改良してきた。 できることから、培養法や GFP 発現などの従来法と組 In situ loop-mediated isothermal amplification、In situ rolling み合わせることで、細胞内への遺伝子の移行段階から、 circle amplification、Cycling primed in situ amplification な 細胞の増殖・遺伝子の保持、遺伝子の発現までの各段階 どの原理を利用して菌体内で特定の塩基配列をもつ を総合的に解析可能となる。原生生物と細菌間の遺伝子 DNA を増幅することで、外来 DNA の細胞内への移行 の動きをより高精度に捉えることで、寄生機構の解明を 段階をシングルセルレベルで捉えることが可能となる。 深化させることを目指す。 独自の手法を用いて細菌間の遺伝子伝播の頻度や範囲を 検討したところ、培養やレポーター発現に依存した従来 法に比べて 100 倍以上高い頻度でかつ広い細菌種に、溶 存態 DNA やファージ粒子内の DNA が細菌に移行し、 ゲノムの多様化に寄与することを明らかにした。また 3 ファージ DNA が、本来の宿主以外にも伝播し細菌の 突然変異に対しても影響を与えることを明らかにした。 原生生物と細菌など寄生・共生関係にある異種生物間 の遺伝子伝播は、ゲノム解析によりその痕跡が確認され ているが、実験的にどの程度の頻度で起こるかは方法論 的制約により未解明のままである。本研究課題では、申 請者らが開発した方法論を応用し、原生生物と細菌間の DNA 分子のフローをシングルセルレベルで可視化する ための技術開発・改良を行う。次に環境試料を含むマイ クロコズムを作製し、寄生関係にある原生生物と未培養 の細菌との間の遺伝子伝播をシングルセルレベルで解析 する。本研究を通じて、DNA 分子フローの視点から寄 生機構の解明を進める道を切り拓く（図 B） 。 異種生物間の遺伝子伝播のモデルとして、アメーバと 環境中の細胞寄生細菌を用いる。環境中ではアメーバ体 内に寄生する細菌は、ヒトに侵入すると同様の機構でマ 16 文部科学省 科学研究費補助金 新学術領域研究「マトリョーシカ型進化原理」News Letter Vol.2 宿主 (原生生物) 捕食者 標識ゲノム DNA GFP発現 プラスミドDNA アメーバ 寄生細菌 寄生 捕食 遺伝子伝播 炭素の流れ 遺伝子伝播 細菌 遺伝子の流れ 遺伝子伝播/ 遺伝子プール 遺伝子伝播 放出/取込み 溶存態DNA 研究内容: 寄生 ファージ 放出 遺伝子プール ① 特定DNA分子を取込んだ細菌を可視化する技術の最適化 ② アメーバと細胞寄生細菌間の遺伝子伝播実験に必要な供与体の作製 ③ マイクロコズムでのアメーバと寄生細菌間の遺伝子伝播の解析 A. 自然環境中の微生物間の相互作用 B. アメーバと寄生細菌間のDNAフローの シングルセルレベルでの解析 ■ 略歴 2000年 2000-2001年 2001-2002年 2002-2007年 2007年-現在 大阪大学大学院薬学研究科博士後期課程修了 マヒドン大学環境資源学部・客員研究員 大日本製薬株式会社 大阪大学大学院薬学研究科・特任研究員、特任助手等 大阪大谷大学薬学部・講師 ■ 最近の主な論文 1. Kenzaka T, Tani K, Nasu M. High-frequency phage-mediated gene transfer in freshwater environments determined at single-cell level. ISME J. 2010 May;4(5):648-59. 2. Kenzaka T, Nasu M, Tani K. Transfer of a phage T4 gene into Enterobacteriaceae, determined at the single-cell level. Appl Environ Microbiol. 2010 Feb;76(4):1274-7. 3. Kenzaka T, Tani K, Sakotani A, Yamaguchi N, Nasu M. High-frequency phage-mediated gene transfer among Escherichia coli cells, determined at the single-cell level. Appl Environ Microbiol. 2007 May;73(10):3291-9. 4. Kenzaka T, Tamaki S, Yamaguchi N, Tani K, Nasu M. Recognition of individual genes in diverse microorganisms by cycling primed in situ amplification. Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;71(11):7236-44. 5. Kenzaka T, Ishidoshiro A, Yamaguchi N, Tani K, Nasu M. rRNA sequence-based scanning electron microscopic detection of bacteria. Appl Environ Microbiol. 2005 Sep;71(9):5523-31. 文部科学省 科学研究費補助金 新学術領域研究「マトリョーシカ型進化原理」News Letter Vol.2 17
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