ヒト末梢⾎リンパ球 6 カラーパネル Sample Preparation 1. 全⾎ 50 μL を、12 × 75mm 試験管の抗体カクテルに添加します。 2. の取扱い説明書を参照してください。事前に抗体のタイトレー Introduction 本稿では、CytoFLEX*フローサイトメーターによる 6 カラー抗体パネルを⽤いたヒト末梢⾎リンパ球の染⾊／溶⾎プロトコールについて⽰します。選択したマーカーは、⼀般的に末梢⾎内の正常および異常リンパ球集団の定量や特徴付けに使⽤さる細胞表⾯ CD 抗原です。 CytoFLEX は、免疫研究に優れた性能を発揮します。特許出願中の WDM（Wavelength Division Multiplexing）検出系は、ソリッドステート、⾼効率、低ノイズの FAPD （ Fiber Array Photodiode Detector）を使⽤し、希少イベントに対してより正確なデータとより優れた検出能を⽰すことができるきわめて⾼い分解能を有しています。本プロトコールは、⾚⾊および⻘⾊レーザー搭載の CytoFLEX を⽤いた 6 カラー解析について説明します。 Materials and tools 1. EDTA 採取ヒト末梢⾎サンプル a. 採取後 24 時間以内に使⽤します 2. 溶⾎剤 3. リン酸緩衝⽣理⾷塩⽔（PBS） 4. 脱イオン⽔ 5. 撹拌 6. 遠⼼機 7. 12×75mm 試験管 8. ピペットおよびチップ 9. ⾚⾊および⻘⾊レーザー搭載 CytoFLEX フローサイトメーター表 1：抗体カクテル単⾊の抗体試薬から抗体カクテルを調製する場合は、各試薬ションを⾏うことを推奨します。 3. 試験管を穏やかに撹拌し、混合します。 4. サンプルを暗所、室温で 15 分間インキュベーションします。 5. 溶⾎剤を添加して静かに撹拌します（試薬の取扱い説明書を参照してください）。 6. 試験管を暗所でインキュベートします。 7. サンプルの⼊った試験管を 1500 rpm で 5 分間遠⼼します。 8. 上清を除去し、PBS 1mL を添加し穏やかに撹拌します。 9. サンプルの⼊った試験管を 1500 rpm で再度 5 分間遠⼼します。 10. 上清を除去し、PBS 500 μL を添加します。 11. サンプルの⼊った試験管を穏やかに撹拌します。試験管を暗所、室温で保管します。1 時間以内に解析します。 Data Acquisition and Analysis 1. フローレートを Low に設定し、サンプルを測定します。 2. デブリを除くため、PerCP-Cy5.5 チャンネルにスレッショルドを設定します。 3. 必要な場合は、ゲインおよびコンペンセーションを調整します。 4. 15,000 イベントを収集します。 5. CD45 Bright／SSC Low 集団にリンパ球ゲートを設定します。 6. “Fit with Sample”機能を⽤いると低シグナルを⾃動表⽰します。 Conclusions 本稿では、CytoFLEX フローサイトメーターにより、ヒト末梢⾎リンパ球の 6 カラーの析で必要な各集団が明確に検出されます。 CytoFLEX および CytExpert は、Beckman Coulter company の 1 社 Xitogen Technologies, Inc.（蘇州）の商標です。Gallios、Kaluza、Krome Orange、Fast track to success は Beckman Coulter, Inc.の商標です。Beckman Coulter、VersaLyse および Beckman Coulter ロゴは、Beckman Coulter, Inc.の商標であり、⽶国特許商標庁（USPTO）に登録されています。Pacific Blue は Molecular Probes, Inc.の商標です。Alexa Fluor は Molecular Probes, Inc.の登録商標です。 2015.9