脂肪酸メチル化キット

L-136
脂肪酸分析用メチルエステル化試薬
脂肪酸メチル化キット
脂肪酸の GC 分析に必要な前処理であるメチル化を効率よく行うための 2 種類の手法を紹介します。2 種類とも従
来法のように高温で反応させる必要がないため、安全で簡便に脂肪酸をメチル化することができます。
脂肪酸メチル化キット▶
脂肪酸メチル化キット , グリセリド用
▶ 詳細は p.2 へ
分析対象
・グリセリド
（トリグリセリド、ジグリセリド、
モノグリセリド、レシチンなどのグリセロ脂質）
・遊離脂肪酸
・ステロールエステル
対象試料
血液、酵母、肝臓、食用油、きな粉、魚油など
▶▶ 詳細は p.4 へ
・グリセリド
（トリグリセリド、ジグリセリド、
モノグリセリド、レシチンなどのグリセロ脂質）
・短鎖脂肪酸を含むグリセリド
食用油、魚油など
試料
試料
メチル化試薬A 0.5ml
A液(溶解液) 1.0ml
メチル化試薬B 0.5ml, 37℃, 1時間
B液(反応液) 0.1ml, 室温, 撹拌3秒, 静置10秒
メチル化試薬C 0.5ml, 37℃, 20分
C液(停止液) 1.0ml
上層
抽出試薬 1.0ml
上層
GC 分析へ
イオン交換水 1.0ml
上層
メチル化脂肪酸精製キットによる精製
※キャピラリーカラム使用時のみ
使用方法
GC 分析へ
従来法
試料
脂質の抽出
・温和な反応温度
・簡便
・室温で反応
・簡便・迅速
ケン化（100℃加熱）エステル型・遊離型
脂肪酸のHCl触媒による
メチル化（100℃加熱）
遊離した脂肪酸の
メチル化（80℃加熱）
GC 分析へ
反応時間
△
（1.5 時間）
◎（1 分以内）
反応温度
〇
（37℃）
◎（室温）
定量性 *
◎
〇
実験精度 *
◎
〇
* 食用油などにも微量に遊離脂肪酸が含まれているため
脂肪酸メチル化キット
特長
分析対象
● 試料中の全構成脂肪酸（スフィンゴ脂質を除く）をメチル化
● 温和な反応温度（37℃）
● 精密分析に最適
● 簡便な操作
● グリセリド（トリグリセリド，ジグリセリド，モノグリセリド，レシチンなどのグリセロ脂質）
● 遊離脂肪酸
● ステロールエステル
（注）スフィンゴ脂質には適用できません。
使用方法
脂肪酸メチル化キット
① 乾燥試料を密閉できる容器に入れます。
② メチル化試薬 A 0.5 ml を加えます。
③ メチル化試薬 B 0.5 ml を加えます。
試料
メチル化試薬A 0.5ml
④ 容器を密閉後、37℃で１時間、または室温で１
晩放置し、反応させます。
メチル化試薬B 0.5ml, 37℃, 1時間
⑤ メチル化試薬 C 0.5 ml を加えます。
メチル化試薬C 0.5ml, 37℃, 20分
⑥ 容器を密閉後、37℃で 20 分放置し、反応させ
ます。
抽出試薬 1.0ml
⑦ 抽出試薬 1.0 ml を加えて、ボルテックスミキ
サーで混合します。
上層
⑧ 2 層に分離したら、上層を別の容器に移します。
イオン交換水 1.0ml
⑨ 採取した上層にイオン交換水 1.0 ml を加えて撹
拌・洗浄します。
上層
⑩ 上層を別の容器に移します。
メチル化脂肪酸精製キットによる精製
※キャピラリーカラム使用時のみ
GC 分析へ
⑪ キャピラリー GC をご使用の場合には、メチル
化脂肪酸精製キットを用いて精製 ( シリカゲル
カートリッジを用いた精製法、自然流下 ) しま
す。
⑫ GC で分析します。
反応機構
● メチル化試薬B による反応
CH2-O-CO-R 1
CH-O-CO-R 2
+
3CH3OH
CH3O-
R 2-COOCH3
R 3-COOCH3
CH2-O-CO-R 3
● メチル化試薬C による反応
R 4-COOH
2
+
CH3OH
H+
CH2-OH
R 1-COOCH3
R 4-COOCH3
+
CH-OH
CH2-OH
従来法との比較
酵母細胞試料に対して、
「脂肪酸メチル化キット」と従来法とでメチル化を行った結果を比較
しました。両者のメチル化率は脂肪酸の鎖長に関わらずほぼ同一となっています。従来法では
試料を高温に加熱する必要があるため、多価不飽和脂肪酸やシクロプロパン脂肪酸などの不安
定な脂肪酸の分解、低級脂肪酸アルキルエステルの蒸散消失などにより定量性が低下する可能
性があります。
脂肪酸メチル化キット
従来法
試料
試料
メチル化試薬A 0.5ml
脂質の抽出
メチル化試薬B 0.5ml, 37℃, 1時間
メチル化試薬C 0.5ml, 37℃, 20分
抽出試薬 1.0ml
ケン化（100℃加熱）エステル型・遊離型
脂肪酸のHCl触媒による
メチル化（100℃加熱）
上層
イオン交換水 1.0ml
遊離した脂肪酸の
メチル化（80℃加熱）
上層
メチル化脂肪酸精製キットによる精製
※キャピラリーカラム使用時のみ
GC 分析へ
GC 分析へ
データご提供：月桂冠株式会社総合研究所
定量性
「脂肪酸メチル化キット」を用いて 10mg から 100mg の酵母乾燥菌体に含まれる総脂肪酸を
測定した結果、菌体量と脂肪酸量は比例関係を示し、不純物の多い試料でも正確に脂肪酸の
測定ができることがわかりました。
脂肪酸量[mg]
3.00
2.00
1.00
0.00
0
20
40
60
80
100
120
酵母試料量[mg]
使用例
データご提供：月桂冠株式会社総合研究所
油脂試料を「脂肪酸メチル化キット」でメチル化後、GC で分析しました。
● バター
● BSA 中の脂肪酸分析
Fatty Acid Methylation Kit Application
Fatty Acid Methylation Kit Application
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
SP-2340, 30m-0.25mmI.D., 0.20μm
30°C(5min) to 200°C at 10°C/min, hold 3min
Helium, 1.0ml/min
FID, 220°C
1.0μl, Split 50:1, 220°C
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
SP-2340, 30m-0.25mmI.D., 0.20μm
100 to 240°C at 8°C/min, hold 2.5min
Helium, 1.0ml/min
FID, 250°C
0.2μl, Split 50:1, 250°C
Sample:
Methylation:
Butter
Fatty Acid Methylation Kit
Fatty Acid Methyl Ester Purification Kit
Sample:
Methylation:
Extracted lipid from BSA
Fatty Acid Methylation Kit
NACALAI TESQUE, INC
NACALAI TESQUE, INC
3
脂肪酸メチル化キット
（グリセリド用）
特長
分析対象
● 試料中のグリセリドの脂肪酸をメチル化
● 室温（加熱装置不要）、短時間（撹拌 3 秒、静置 10 秒）で反応
● 簡易分析に最適
● 加熱しないため揮発性の短鎖脂肪酸にも適用可能
● 簡便な操作
● グリセリド（トリグリセリド，ジグリセリド，モノグリセリド，レシチンなどのグリセロ脂質）
（注）遊離脂肪酸、ステロールエステル、スフィンゴ脂質には適用できません。
本キットは、グリセリドの脂肪酸組成の測定に適した製品です。全構成脂肪酸（スフィンゴ脂質を除く）
を分析対象とする場合には、遊離脂肪酸やステロールエステルもメチル化できる「脂肪酸メチル化キッ
ト」
（p.2 でご紹介 ) をご使用ください。
使用方法
脂肪酸メチル化キット(グリセリド用)
試料
A液(溶解液) 1.0ml
B液(反応液) 0.1ml, 室温, 撹拌3秒, 静置10秒
C液(停止液) 1.0ml
上層
GC 分析へ
① 油脂試料
（50mg 以下）
を容器に入れます。
② A液
（溶解液）1.0 ml を加え、試料を溶解させます。
③ B液
（反応液）0.1 ml を加え、ボルテックスミキサーで約 3 秒撹拌します。
④ 約 10 秒静置後、C 液
（停止液）
1.0 ml を加え、ボルテックスミキサーで 5∼10 秒撹拌します。
⑤ 静置すると 2 層に分離しますので、上層をオートサンプラーバイアルなどの別の容器に移します。
⑥ GC で分析します。
（注）
本キットはメチル化脂肪酸精製キット
（p.2 以降にご紹介）
を使用しません。
反応機構
グリセリドとメタノールとのエステル交換反応
（メタノリシス）によってメチル化を行います。
CH2-O-CO-R 1
CH-O-CO-R 2
CH2-O-CO-R 3
4
+
3CH3OH
CH3O-
CH2-OH
R 1-COOCH3
R 2-COOCH3
R 3-COOCH3
+
CH-OH
CH2-OH
トリグリセリド（トリオレイン）
10 mg を「脂肪酸メチル
化キット（グリセリド用）
」を用いてメチル化し、シリカ
ゲル TLC において、メチル化の進行を確認しました。
反応の確認
- 脂肪酸メチル
・展開溶媒：ヘキサン / - ブチルメチルエーテル /
酢酸 = 92 / 8 / 0.4
・発色：50% 硫酸を噴霧後、137℃、15 分間加熱。
（結果）
- トリグリセリド
トリグリセリドがメチル化されていることが確認できました。
- 脂肪酸
反応前反応後
使用例
標準
● イワシからの抽出油の脂肪酸分析
（試料の処理方法）
Fatty Acid Methylation Kit Application
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
Rtx®-225, 30m-0.25mmI.D., 0.25μm
200 to 220°C at 2°C/min, hold 10min
Helium, 35cm/s
FID, 280°C
1.0μl, Split 40:1, 260°C
Sample:
Methylation:
Extracted oil from sardine
Fatty Acid Methylation
Kit for glycerides
Data courtesy of Dr. K. Ichihara, Kyoto Integrated Science &
Technology Bio-Analysis Center, ASTEM
① 乳鉢と乳棒を用いて，小形のイワシ
（全体の 2/3
程度）約 10 g をアセトン 30 ml、次いでヘキサ
ン 20 ml で抽出し、ろ過しました。
② ろ液を合わせて水 30 ml を加えて混合しました。
③ 分層したヘキサン層を回収し，ロータリーエバ
ポレーターで溶媒を留去しました。
④ 得られた油から約 20 mg を「脂肪酸メチル化
キット（グリセリド用）
」を用いてメチル化しま
した。
NACALAI TESQUE, INC
（結果）
飽和脂肪酸の他、DHA や EPA などの不飽和脂肪酸
を多く含むことが確認できました。
● 乳脂肪の脂肪酸分析
（試料の処理方法）
Fatty Acid Methylation Kit Application
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
Rtx®-225, 30m -0.25mmI.D., 0.25μm
60°C(2min) to 210°C at 20°C/min, hold 10min
Helium, 35cm/s
FID, 280°C
1.0μl, Split 20:1, 260°C
Sample:
Methylation:
Milk
Fatty Acid Methylation Kit for glycerides
① 牛乳 0.5 ml を「脂肪酸メチル化キット（グリセ
リド用）
」のキット試薬 A ／溶解液 2 ml と混合
しました。
② 得られた有機溶媒層 1 ml を「脂肪酸メチル化
キット（グリセリド用）
」を用いてメチル化しま
した。
（結果）
Data courtesy of Dr. K. Ichihara, Kyoto Integrated Science &
Technology Bio-Analysis Center, ASTEM
NACALAI TESQUE, INC
「脂肪酸メチル化キット（グリセリド用）」によるメ
チル化は、室温で短時間であることから、酪酸メ
チル
（4:0）やヘキサン酸メチル
（6:0）などの揮発性の
高い短鎖脂肪酸メチルも分析できています。
本ページのデータご提供：公益財団法人京都高度技術研究所京都バイオ計測センター市原先生
5
使用例
㻌つづき ● 酒造好適米 ( 日本晴 ) 中の脂肪酸分析（精米歩合の違いによる影響）
（試料の処理方法）
① 試料
（玄米、90% 精米、70% 精米 / 各 100 mg）を破砕しました。
② 破砕した試料にアセトン 1ml を加え、ボルテックスミキサー
による攪拌後、アセトン溶液を回収しました。
③ 残渣に等量のヘキサンを加え、ボルテックスミキサーによる攪
拌後、ヘキサン溶液を回収し、アセトン溶液と合わせました。
④ ③の混合溶液にアセトンと等量の超純水を加えて軽く撹拌しま
した。
⑤ ④溶液を 2,000 rpm、3min 遠心分離し、上層のヘキサン溶液を回収しました。
⑥ ヘキサン溶液を遠心エバポレーターにかけて濃縮して油脂試料としました。
⑦ 米 50 mg 相当の油脂試料を「脂肪酸メチル化キット
（グリセリド用）
」を用いてメチル化しました。
GCによる定量
Fatty Acid Methylation Kit Application
5.0
4.5
Stabilwax, 30m-0.53mmI.D., 0.25μm
50°C(1min) to 230°C at 15°C/min, hold 8min
Helium, 2.95ml/min
FID, 250°C
1.0μl, Split 3:1, 250°
Extracted lipid from unpolished rice
4.0
脂肪酸量[mg / 米1g]
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
Sample:
3.5
3.0
玄米
2.5
90%精米
2.0
70%精米
1.5
1.0
0.5
0.0
C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0
● 香気成分の生成が異なる清酒酵母の脂肪酸分析
（試料）
Fatty Acid Methylation Kit Application
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
Sample:
・酵母親株 1103 株
・酵母変異株 0101 株
（セルレニン耐性）
SP-2380, 30m-0.25mmI.D., 0.20μm
70°C(1min) to 230°C at 20°C/min, hold 7min
Helium, 0.6ml/min
MSD, 230°C
2.0μl, Split 20:1, 250°C
Yeast (1103)
（試料の処理方法）
① 酵母培養
（YPD, 30℃ , ∼ 24 hr）
② 集菌後、蒸留水で 2 回ウォッシュ
③ 一晩凍結乾燥
④ 脂質抽出
（アセトン・ヘキサン抽出）
⑤「脂肪酸メチル化キット
（グリセリド用）」を用
いてメチル化
NACALAI TESQUE, INC
Data courtesy of Gekkeikan Sake Company, Ltd.
酵母細胞内の脂肪酸組成
定量性
0.40
500
400
1103株
脂肪酸量[μg]
300
200
100
0
0
50
100
150
酵母試料量[mg]
200
250
本ページのデータご提供：月桂冠株式会社総合研究所
6
トリグリセリド由来脂肪酸量[mg/g dry cells]
親株
変異株
0.30
0.20
0.10
0.00
使用例
㻌つづき油脂試料を「脂肪酸メチル化キット（グリセリド用）」キットでメチル化後、GC で分析しました。
● 大豆油
● マグロからの抽出油
Fatty Acid Methylation Kit Application
Fatty Acid Methylation Kit Application
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
Rtx®-225, 30m-0.25mmI.D., 0.25μm
205°C
Helium, 35cm/s
FID, 280°C
1.0μl, Split 50:1, 260°C
Column:
Sample:
Methylation:
Soybean oil
Fatty Acid Methylation Kit
for glycerides
Sample:
Methylation:
Data courtesy of Dr. K. Ichihara, Kyoto Integrated Science &
Technology Bio-Analysis Center, ASTEM
Carrier:
Detection:
Injection:
SP-2340, 30m 0.25mmI.D., 0.20μm
100 to 240°C at 8°C/min, hold 2.5min
Helium, 1.0ml/min
FID, 250°C
0.2μl, Split 50:1, 250°C
Extracted oil from tuna(chu-toro)
Fatty Acid Methylation Kit
for glycerides
NACALAI TESQUE, INC
● イノシシの脂身
NACALAI TESQUE, INC
● ポテトチップス
Fatty Acid Methylation Kit Application
Fatty Acid Methylation Kit Application
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
SP-2340, 30m-0.25mmI.D., 0.20μm
100 to 240°C at 8°C/min, hold 2.5min
Helium, 1.0ml/min
FID, 250°C
0.2μl, Split 50:1, 250°C
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
Rtx®-225, 30m-0.25mmI.D., 0.25μm
205 C
Helium, 35cm/s
FID, 280°C
1.0μl, Split 100:1, 260°C
Sample:
Methylation:
Wild boar fat
Fatty Acid Methylation Kit
for glycerides
Sample:
Methylation:
Potato chips
Fatty Acid Methylation Kit
for glycerides
NACALAI TESQUE, INC
● タバコ緑葉脂質
Data courtesy of Dr. K. Ichihara, Kyoto Integrated Science &
Technology Bio-Analysis Center, ASTEM
● 卵黄リン脂質
Fatty Acid Methylation Kit Application
Fatty Acid Methylation Kit Application
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
Rtx®-225, 30m-0.25mmI.D., 0.25μm
205°C
Helium, 35cm/s
FID, 280°
1.0μl, Split 30:1, 260°C
Column:
Oven:
Carrier:
Detection:
Injection:
Rtx®-225, 30m-0.25mmI.D., 0.25μm
205 to 215°C at 3°C/min, hold 10min
Helium, 35cm/s
FID, 280°C
1.0μl, Split 8:1, 260°C
Sample:
Methylation:
Extracted lipid from green leaf of tobacco
Fatty Acid Methylation Kit for glycerides
Sample:
Extracted lipid from yolk of chicken
egg (Purified with silica gel)
Fatty Acid Methylation Kit
for glycerides
Methylation:
Data courtesy of Dr. K. Ichihara, Kyoto Integrated Science &
Technology Bio-Analysis Center, ASTEM
NACALAI TESQUE, INC
NACALAI TESQUE, INC
主成分：ガラクト脂質 ( 糖脂質 )、リン脂質
Data courtesy of Dr. K. Ichihara, Kyoto Integrated Science &
Technology Bio-Analysis Center, ASTEM
NACALAI TESQUE, INC
主成分：ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノー
ルアミン
7
キット内容
● 脂肪酸メチル化キット（100 回用）
試薬名
容量
数量
メチル化試薬 A
50 ml
1
メチル化試薬 B
50 ml
1
メチル化試薬 C
50 ml
1
250 ml
1
抽出試薬
● メチル化脂肪酸精製キット (50 回用 )
試薬名または器材名
容量
数量
前洗浄液
200 ml
1
洗浄液
200 ml
1
溶出液
200 ml
1
−
50
シリカゲルカートリッジカラム
● 脂肪酸メチル化キット , グリセリド用 (100 回用 )
容量
数量
A液
（溶解液）
試薬名
100 ml
1
B液
（反応液）
10 ml
1
C液
（停止液）
100 ml
1
価格表
製品名
規格
貯法
製品番号
容量
価格
脂肪酸メチル化キット（100 回用）
SP
室温
06482-04
100 tests
33,000
メチル化脂肪酸精製キット（50 回用）
SP
室温
06483-94
50 tests
29,400
脂肪酸メチル化キット , グリセリド用 (100 回用 )
SP
室温
13246-84
100 tests
33,000
上記製品は、月桂冠株式会社が公益財団法人京都高度技術研究所京都バイオ計測センター市原先生との共同研究により特許を取得し、ナカラ
イテスク株式会社が許諾を得て製造販売しています。[ 特許第 4942380 号 ]
ご注意試験・研究用以外には使用しないでください。
※掲載の内容は、'15 年 4 月現在の情報に基づいております。
※価格に消費税は含まれておりません。
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